Por Beatriz Naranjo Martínez, Mª del Carmen Nogales Valenciano y Sara Ortiz Planchuelo. Grado en biología sanitaria – Universidad de Alcalá de Henares

El retículo endoplasmático (RE) es un orgánulo de la célula que regula la síntesis, plegamiento, maduración, estabilización, tráfico y degradación de aproximadamente un tercio de las proteínas totales de la célula. El destino de estas proteínas es ser secretadas por la célula, así como residir en la membrana plasmática, el aparato de Golgi, los lisosomas y el propio RE.

Estas proteínas sufren modificaciones postraduccionales, plegamiento y maduración hasta alcanzar su estado funcional terciario o cuaternario.

El plegamiento ocurre gracias a la intervención de chaperonas y otras enzimas, que reconocen las proteínas desplegadas o mal plegadas y las pliegan para que logren una conformación estable funcionalmente activa. No obstante, este proceso es el punto donde más errores se producen en todo el proceso de síntesis de proteínas. Por ello, el RE posee un sistema de control de calidad del plegamiento, que consiste en exportar únicamente aquellas proteínas plegadas correctamente y dirigir a la degradación las que no lo están, evitando así la acumulación de proteínas aberrantes que puede conducir a la apoptosis.

Un fallo en este control de calidad puede generar múltiples enfermedades relacionadas con el mal plegamiento de proteínas, como diabetes mellitus, hígado graso, neurodegeneración, inflamación y cáncer.

Síntesis de proteínas en el retículo endoplasmático

Las proteínas destinadas al RE comienzan su síntesis en los ribosomas libres en el citosol, donde se traduce, en primer lugar, un péptido señal de 16 a 30 aminoácidos, que contiene un núcleo de aminoácidos hidrofóbicos, que es esencial para su función (Figura 1, paso 1).

Una ribonucleoproteína citosólica, la partícula de reconocimiento de señal (SRP), se une a la subunidad 60S y al péptido señal en cuanto éste emerge del ribosoma (Figura 1, paso 2), de manera que detiene la traducción para que el polipéptido naciente pueda ser translocado al RE.

Este complejo se dirige a la membrana del RE, donde el receptor de la SRP reconoce el extremo de SRP no unido al ribosoma (Figura 1, paso 3). La unión del complejo ribosoma-péptido señal-SRP al receptor de SRP conduce a la apertura del complejo Sec61 o translocón en la membrana del RE, que actúa como un poro acuoso. Esta unión al translocón permite la liberación de SRP por la hidrólisis de GTP, la reanudación de la traducción y la entrada del polipéptido al RE a medida que se va sintetizando (Figura 1, paso 4). Todo este proceso requiere ATP. [1,2,3]

Dependiendo del destino de la proteína naciente, la síntesis continua de forma distinta:

• Si la proteína se va a secretar, a medida que la cadena polipeptídica se va alargando, pasa a través del canal del translocón hacia la luz del RE, donde el péptido señal es cortado inmediatamente por la peptidasa señal y posteriormente degradado (Figura 1, paso 5). La cadena continúa sintetizándose (Figura 1, paso 6) hasta la terminación de la traducción del mRNA, de manera que se libera el ribosoma (Figura 1, paso 7) y se cierra el translocón (Figura 1, paso 8).
• Si la proteína va a formar parte de una membrana biológica, poseerá un péptido de señal-anclaje, que posee una región hidrofóbica que le sirve para anclarse a la membrana del RE y no ser escindida. [4]

Plegamiento de proteínas

Una vez el polipéptido emerge del translocón, ha de plegarse para adquirir su conformación funcionalmente activa (estado nativo), la cual es la más estable [5, 6]. Para hacer posible la espontaneidad del proceso, se “ocultan” los residuos hidrófobos de aminoácidos no polares en el núcleo de la proteína y se exponen las cadenas laterales hidrófilas al entorno acuoso. 

Primero se produce el plegamiento co-traduccional temprano, en el cual se forman estructuras secundarias. Una vez la proteína se libera del translocón, se produce el plegamiento postraduccional, que predomina sobre el primero y da lugar a las proteínas funcionales.

El proceso de plegamiento ha de llevarse a cabo en un tiempo biológicamente aceptable. Para ello, se limitan el número de conformaciones que pueden adoptar los polipéptidos, mediante la formación de interacciones hidrofílicas como puentes salinos y enlaces disulfuro [5].

La formación de estas interacciones co‐ y postraduccionales es catalizada por una maquinaria de modificación y plegamiento de proteínas residente en RE, que comprende una red de chaperonas, enzimas glucosilantes, oxidorreductasas e isomerasas que actúan simultánea o secuencialmente [5, 6].

A menudo las proteínas pequeñas con un solo dominio adoptan su estado nativo de manera espontánea, sin necesidad de la intervención de esta maquinaria, al contrario de lo que ocurre en el caso de proteínas con estructuras más complejas que se plegaran más lentamente y, por tanto, requieren de diferentes enzimas para alcanzar su conformación activa en un tiempo aceptable biológicamente [7].  

Chaperonas

Las chaperonas moleculares se definen como «proteínas que interactúan, estabilizan o ayudan a una proteína no nativa a adquirir su conformación nativa, pero no están presentes en la estructura funcional final» [8]. Fueron identificadas por su mayor abundancia después de su exposición al choque térmico, por lo que son conocidas como Hsp, por sus siglas en inglés Heat Shock Proteins [5].

Estos catalizadores moleculares se encuentran en todos los orgánulos y compartimentos en las células encargadas de la síntesis y modificación post-traduccional, dado que se han conservado a lo largo de la evolución [9]. En el RE destacan la Hsp70 BiP (Grp78), la Hsp90 Grp94 (gp96) y las chaperonas de lectina calnexina (CNX) y calreticulina (CRT), que son exclusivas del RE [5]. La mayoría de los factores de plegamiento del RE se unen a Ca²⁺ y dependen de él para funcionar.

Las chaperonas actúan como enzimas acelerando las etapas limitantes de la reacción de plegamiento, es decir, disminuyen la barrera energética entre el estado nativo y no nativo de la proteína [6]. Para ello, reconocen dominios hidrofóbicos expuestos al medio acuoso, los cuales señalizan que la proteína está mal plegada, es un intermediario de plegamiento o forma parte de un polímero no ensamblado. Una vez reconocidos estos dominios hidrofóbicos, los ocultan y forman interacciones no covalentes con ellos para dar lugar al estado nativo, que es estable contra la agregación multimérica irreversible.

Si la proteína ha alcanzado su conformación nativa, no podrá volver a unirse a las chaperonas, pero si este plegamiento se ha producido de manera incompleta, habrá residuos hidrofóbicos expuestos que permitirán una nueva oportunidad para llevar a cabo el plegamiento correctamente [4].

Así, las chaperonas pueden diferenciar específicamente las etapas de plegamiento para una amplia gama de proteínas y, por tanto, actúan como supervisoras de la calidad del plegamiento proteico [9].

Control de calidad del RE

A pesar de la intervención de las maquinarias de plegamiento proteico, el plegamiento es el punto más propenso a errores desde la transcripción hasta lograr la proteína funcional.

El RE posee una concentración de calcio y un potencial redox mayor que el citosol, lo cual facilita el funcionamiento adecuado de las maquinarias de plegamiento. Esto le otorga la capacidad de realizar un control de calidad del plegamiento, mediante el monitoreo de la cantidad de proteínas mal plegadas en el RE, y un control de cantidad, al eliminar copias excesivas de ciertas proteínas para coordinar su plegamiento con las demandas fisiológicas y patológicas de la célula [9]. 

Este control consiste en detectar aquellas proteínas que tienen defectos de plegamiento o se encuentran en exceso para dirigirlas a vías de degradación, pasando únicamente a la vía secretora aquellas proteínas correctamente plegadas [10].

En RE de mamíferos existen dos mecanismos distintos de control de calidad: la vía de plegamiento general y la vía específica de glucoproteínas [5].

En ausencia de N-glucanos dentro de los primeros 50 residuos de aminoácidos, la proteína naciente se dirige hacia la vía de plegamiento general, de manera que se une primero a la chaperona BiP (Grp78). En presencia de dichos N-glucanos, la proteína se dirige hacia la vía de plegamiento específica de glucoproteínas, de manera que interacciona con las chaperonas calnexina-calreticulina (CNX / CRT) para sufrir procesos de modificación en el oligosacárido hasta alcanzar el plegamiento adecuado. No obstante, debido a la importancia de BiP en la translocación, ésta puede interaccionar primero de manera transitoria con la glucoproteína [11]. Ambos mecanismos actúan de forma coordinada en la maduración proteica para que únicamente sean exportadas las proteínas funcionales.

Cuando las proteínas alcanzan una conformación estable funcionalmente activa, pueden ser exportadas mediante vesículas al aparato de Golgi.

Las proteínas que permanecen mal plegadas tras varios intentos de plegamiento son finalmente retrotraslocadas al citosol para ser degradadas en el proteasoma mediante la vía de degradación asociada al RE (ERAD). En caso de que se formen cuerpos de inclusión proteicos debido a la agregación, éstos son degradados por autofagia mediante la vía de degradación en lisosomas asociada al RE (ERLAD).

Ante condiciones de estrés reticular, la acumulación de proteínas mal plegadas puede superar un umbral crítico, lo cual induce la activación de la respuesta de proteína desplegada (UPR). Este mecanismo trata de promover la supervivencia celular mediante el restablecimiento de la homeostasis, por un lado, controlando la síntesis y degradación de estas proteínas, y por otro, regulando la transcripción de los factores que intervienen en esta proteostasis.

Cuando el estrés del RE es demasiado alto, la UPR puede no ser suficiente para recuperar la homeostasis, de manera que los niveles de proteínas mal plegadas siguen siendo altos y se activan vías pro-apoptóticas para evitar la supervivencia de células aberrantes [7].

Vía de plegamiento general

Como ya hemos mencionado, en la vía general de plegamiento intervienen una chaperona de la familia Hsp70, BiP, y enzimas de plegamiento entre las que destacan las proteínas disulfuro isomerasas (PDI) (PDIA1), y peptidil prolil cis‐trans isomerasas (PPI) [12].

La proteína de unión a inmunoglobulina (BiP) es la chaperona más abundante y versátil de la célula, considerándose el regulador maestro del plegamiento de proteínas en el RE. Entre sus funciones destacan:

• Interviene en la translocación de cadenas nacientes al lumen reticular.
• Participa en el plegamiento y la oligomerización de proteínas.
• Interviene en la preparación de las proteínas no nativas para ser translocadas al citosol y degradas en el proteasoma.
• Regula la respuesta a proteína desplegada (UPR).
• Ayuda a mantener la homeostasis del Ca²⁺, lo cual es fundamental para el plegamiento de proteínas, pues la mayoría de los factores son dependientes de Ca²⁺ [4, 6].

La actividad ATPasa de BiP está regulada por las proteínas J (ERdj1–7) y factores de intercambio de nucleótidos (Grp170 y Sil1). Los ERdjs actúan reclutando a BiP para realizar diferentes procesos como la traslocación (ERdj1 y ERdj2) (Figura 3, paso 1), el plegamiento (con ERdj3 y ERdj6) (Figura 3, paso 2) y la degradación (ERdj4 y ERdj5) (Figura 3, paso 3a) [8].

Cuando se une ATP al dominio de unión de nucleótidos de BiP, el dominio de unión a sustrato alcanza su conformación abierta, en la cual se une de manera transitoria a las regiones hidrofóbicas que están expuestas en la proteína plegada incompletamente (Figura 2, paso 1). Al hidrolizarse este ATP, se desacoplan los dominios, y este último adquiere su conformación cerrada, uniéndose de forma más estrecha a su proteína sustrato, de manera que facilita su plegamiento (Figura 2, paso 2). Las proteínas ERdj intervienen en ambos pasos, en primer lugar, transfiriendo las proteínas desplegadas y, en segundo lugar, produciendo la hidrólisis de ATP.

El ADP resultante de la hidrólisis es sustituido por ATP gracias a la intervención de factores de intercambio de nucleótidos (Figura 2, paso 3). Esto produce un cambio conformacional que libera la proteína diana, permitiendo que la chaperona sea reutilizada tras la intervención de las proteínas ERdj (Figura 2, paso 4).

Grp94 es otra chaperona de la familia Hsp90, sin actividad ATPasa, que se une a los sustratos después de BiP (Figura 3, paso 4) y es esencial en muchos procesos en el RE, incluido el plegamiento de proteínas, el control de calidad del RE, la respuesta al estrés y la amortiguación de Ca²⁺ [5, 6].

Además de estas chaperonas, en el plegamiento intervienen enzimas, destacando las peptidil prolil cis‐trans isomerasas (PPI) y las disulfuro isomerasas (PDI).  

Las peptidil prolil cis‐trans isomerasas (PPI) catalizan la isomerización del enlace peptídico que precede a los residuos de prolina desde la conformación trans a la cis y viceversa. Esto es importante porque, durante el plegamiento, pueden ser necesarias múltiples isomerizaciones cis-trans hasta alcanzar la estructura proteica correcta. Este cambio conformacional es extremadamente lento, por lo que se considera un paso limitante en el plegamiento de proteínas [5].

Las disulfuro isomerasas (PDI) catalizan la formación, reducción e isomerización de puentes disulfuro, que estabilizan la estructura de la proteína nativa y los complejos oligoméricos. Esta reacción también es un paso limitante de la velocidad en el plegado [12].

Cuando las proteínas están bien plegadas, salen del RE y viajan al Golgi (Figura 3, paso 3b), mientras que las proteínas mal plegadas se dislocan al citosol para su degradación [5].

Vía de plegamiento específica de glucoproteínas

La mayoría de las proteínas solubles y de membrana que se dirigen a la vía secretora reciben glucanos ligados a N a medida que se traducen y translocan al RE (Figura 4, paso 1). Esto juega un papel crucial en el plegamiento de proteínas en el RE, principalmente a través de su interacción con calnexina (CNX) y calreticulina (CRT) [12, 13].

La N-glucosilación comienza cuando la oligosacariltransferasa (OST), una enzima anclada al translocón, transfiere un complejo de 14 azúcares (2 moléculas de N-acetil-glucosamina, 9 moléculas de manosa y 3 moléculas de glucosa) de un dolicol pirofosfato de la membrana del RE al residuo N de asparagina (Asn) de una secuencia aceptora (N-glicosilación) (Figura 4, paso 2) [5, 7, 12].

Las chaperonas calnexina y calreticulina (CNX / CRT) únicamente se unen a intermediarios proteicos monoglucosilados. Estos intermediarios se logran gracias a la previa escisión secuencial de las dos primeras glucosas de las glucoproteínas por las glucosidasas I y II (Figura 4, paso 3).  

La calnexina es una proteína integral de la membrana del RE y la calreticulina es su parálogo soluble en el lumen de éste. Ambas proteínas poseen un dominio de unión a glucanos similar a lectina y un brazo flexible, el dominio P, que recluta a otras chaperonas. Además, se estabilizan cuando se unen a calcio [4].

A través de sus dominios P, se unen a chaperonas de función específica como ERp57, que es una disulfuro isomerasa (PDI) [14]; ciclofilina B, que es una peptidil prolil cis‐trans isomerasa (PPIasas); y ERp29, que tiene función de chaperona general (Figura 4, paso 4) [7, 12]

Una vez realizada la función de plegamiento, la glucosidasa II recorta la glucosa restante, liberando la proteína del complejo de chaperonas (Figura 4, paso 5).

La glucoproteína glucosiltransferasa (UGGT1) reconoce imperfecciones estructurales en las glucoproteínas que no han conseguido alcanzar su estado nativo tras el plegamiento y monoglucosila de nuevo sus cadenas laterales a partir del donador UDP-glucosa, de manera que pueden unirse otra vez a la calnexina-calreticulina para intentos de plegamiento adicionales (Figura 4, paso 5) [12].

Además, esta proteína monoglucosilada también actúa como sustrato de la glucosidasa II, que compite con UGGT1 con efectos opuestos. La situación en el RE va a condicionar la disponibilidad de estas dos enzimas y, por tanto, el desplazamiento de este equilibrio; por ejemplo, cuando se produce estrés en el retículo aumenta la expresión de UGGT1, por lo que este equilibrio se desplaza hacia la monoglucosilación para que se incremente la tasa de plegamiento.

Por tanto, UGGT1 actúa como un sensor de reconocimiento de proteínas mal plegadas, pues determina si una proteína sale del RE o se retiene para una mayor intervención. [7, 15]

Una proteína puede recorrer el ciclo CNX/CRT numerosas veces hasta que alcanza su conformación nativa. Para salir de este ciclo, el residuo de manosa más externo del brazo que contiene glucosa es eliminado por una manosidasa (Figura 4, paso 6 y 7), evitando que la UGGT1 vuelva a glucosilar.

Si las proteínas consiguen un plegamiento correcto, tras esta escisión, pueden ser exportadas fuera del RE [7]. Sin embargo, si las proteínas no consiguen plegarse adecuadamente tras varios ciclos, se dirigen a la vía de degradación de proteínas asociada a RE (ERAD).

ERAD

Cuando las proteínas no adquieren su forma nativa tras varios intentos de plegamiento, las células activan la vía de degradación asociada al RE (ERAD) para evitar que las proteínas se acumulen dando lugar al estrés del RE, el cual pondría en peligro la supervivencia celular. En este mecanismo las proteínas mal plegadas son retrotranslocadas al citosol para su posterior ubiquitinación y degradación por el proteosoma 26S, pues el RE no posee mecanismos de degradación [1].

Vía ERAD de proteínas glucosiladas

Salida del ciclo de calnexina/calreticulina

Se cree que la salida de las glucoproteínas mal plegadas del ciclo de CXN/CRT ocurre cuando la α1,2-manosidasa I del RE (ERManI) corta el residuo de manosa más externo del brazo que contiene glucosa, dando lugar a un residuo de 8 manosas en vez de 9 como el glucopéptido original, de manera que la UGGT1 no puede volver a monoglucosilar. [17, 18, 19].

No obstante, esta desmanosidación también ocurre en las proteínas bien plegadas, por lo que una proteína cuyo N-glicano se recorta de 9 a 8 manosas puede ser sustrato tanto para el transporte a Golgi como para ERAD [20].

Recientemente se ha demostrado que, si la proteína se pliega adecuadamente, se incorpora a vesículas COPII que se dirigen al Golgi. Sin embargo, si no se pliega, las proteínas similares a la α-manosidasa I (EDEM1-3) reconocen el glucano recortado y producen un recorte adicional de manosa que conducirá a los siguientes pasos de la vía de degradación (Figura 5) [18, 20].

A partir de aquí, ERAD ocurre en un proceso de múltiples pasos que comprende el reconocimiento, translocación y ubiquitinación de proteínas ER para la degradación proteasomal citosólica. 

Reconocimiento

La acción secuencial de ERManI y EDEM1 en glicoproteínas mal plegadas da como resultado la exposición de un resto de manosa unido a α1,6, que es reconocido por el dominio receptor de manosa-6-fosfato de las lectinas: osteosarcoma amplificado 9 (OS-9) y proteína transactivada XTP3 (XTP3-B). Estas lectinas junto con los sustratos ERAD son reclutados Sel1L, una proteína asociada con el complejo de retrotranslocación [17, 18].

Translocación y ubiquitinación

Antes de la translocación, las proteínas deben abrir su estructura parcialmente plegada, mediante la ruptura de los puentes disulfuro por disulfuro isomerasas (PDI) y BiP.

En el complejo de retrotranslocación de la membrana del RE destaca la proteína Derlin-1, que forma canales de retrotranslocación en la membrana del RE [20].

Como se ha mencionado, OS-9 y XTP3-B unidos a la proteína desplegada son reclutados por la SEL1L, que se encuentra asociada con Hrd1, una ubiquitina ligasa transmembrana que a su vez está unida al complejo de retrotranslocación.

La ubiquitinación de Hdr1 produce un cambio conformacional en éste, que permite la inserción del polipéptido por el canal Hdr1. A medida que la proteína emerge en el citosol, será poli-ubiquitinado por Hrd1 y las enzimas E2 de conjugación de ubiquitina asociadas. La AAA-ATPasa p97, se recluta en la membrana del RE a través de su asociación con VIMP y proporciona la energía necesaria para extraer las proteínas de la membrana del RE.

Finalmente, la cadena polipeptídica es dirigida hacia este proteasoma por Dsk2 y Rad23, una vez la N-glicanasa ha recortado el glicano restante de la cadena polipétidica para que esta última pueda entrar por el poro del proteasoma dónde finalmente serán degradadas. [20, 21].

Vía ERAD de proteínas no glucosiladas

La vía ERAD de las proteínas no glicosiladas está menos estudiada, pero fundamentalmente difiere del proceso de las glucosiladas en el reconocimiento de los sustratos desplegados (Figura 5). La decisión de dirigir las proteínas a la vía de degradación implica la unión de la proteína a las co-chaperonas pro-degradación: ERdj4, que está asociado con Derlin1, y ERdj5, que actúa como disulfuro isomerasa, induciendo un mayor despliegue de las proteínas para dirigirlas a ERAD, mientras que ERdj4 está asociado con Derlin1 [20].

ERLAD 

Las proteínas mal plegadas que no pueden ser reconocidas y degradadas por ERAD, son autofagocitadas para su degradación en lisosomas asociada al ER (ERLAD) [16, 22].

Estrés del RE

La eficiencia del plegamiento de proteínas en el RE se puede ver alterada por un amplio grupo de alteraciones celulares que conducirán a la acumulación de proteínas mal plegadas dentro del orgánulo que, si supera un umbral crítico, provocará estrés en el RE. Las condiciones que desencadenan este estrés incluyen: falta de nutrientes, hipoxia, mutaciones puntuales en proteínas secretadas que intervienen en el plegamiento o causan agregación y pérdida de la homeostasis del calcio. Así, las células han desarrollado un sofisticado sistema para detectar y responder frente al estrés antes de que peligre su supervivencia [23].

UPR determina el destino celular bajo estrés en el RE

Ante el estrés del RE, las células activan una compleja red de vías de señalización intracelular interconectadas, la respuesta de proteína desplegada (UPR). Esta vía es iniciada por tres transductores ubicados en la membrana del RE, PERK, IRE1 (α y β) y ATF6, que contienen un dominio luminal RE capaz de detectar directa o indirectamente la acumulación crítica de proteínas mal plegadas, de manera que transmiten esta información al citoplasma y al núcleo [23, 24].

La UPR se activa para restaurar la homeostasis del plegamiento de proteínas del RE, pero si el estrés ER no se mitiga y amenaza la supervivencia celular, la UPR desencadena la apoptosis [25]. Esta vía se activa para restaurar la homeostasis del plegamiento de proteínas del RE.

UPR adaptativa: hacia la supervivencia celular

Ante el estrés agudo del RE, la UPR se activa para restaurar la homeostasis del plegamiento de proteínas del RE. Esto implica, en primer lugar, la expansión de la membrana del RE y un aumento en el plegamiento y transporte de proteínas en el RE, y, posteriormente, la atenuación transitoria de la síntesis de proteínas y un aumento en la degradación de proteínas asociadas al RE (Figura 6).

IRE1α

IRE1α (proteína 1α que requiere inositol) es una glicoproteína transmembrana del RE, que posee un dominio citoplasmático con actividad quinasa y RNasa, y un dominio luminal que detecta a las proteínas mal plegadas [4].

Esta proteína mantiene en un estado reprimido en condiciones sin estrés a través de una asociación con BIP (26). Durante el estrés del retículo endoplásmico, BIP se disocia para unirse a las proteínas mal plegadas. Esto conduce a la fosforilación y dimerización parcial de IRE1α, que estimula su actividad RNasa que realizar el corte y empalme de la proteína de unión a caja X (XBP1).

XBP1s controla la transcripción de genes que codifican proteínas implicadas en el plegamiento de proteínas, la degradación asociada a RE (ERAD), el control de calidad de proteínas y la síntesis de fosfolípidos, esta última para dar como resultado una expansión del RE.

IRE1α también media la descomposición del ARNm para reducir la carga de plegamiento de proteínas en el RE, lo que se denomina descomposición dependiente de IRE1 regulada (RIDD). Por otro lado, induce ‘vías de estrés de alarma’, incluidas las impulsadas por la quinasa N-terminal JUN (JNK) y el factor nuclear κB (NF-κB), mediante la unión a proteínas adaptadoras [25].

PERK

PERK (quinasa del RE pancreático)es una proteína transmembrana, que reprime la traducción de proteínas en éste. Esta proteína fosforila la serina 51 de eIF2α (subunidad α del factor de inicio de la traducción 2 en eucariotas) en respuesta al estrés.

La fosforilación de eIF2α, por un lado, reduce la formación de complejos de iniciación de la traducción y, por tanto, lleva a una disminución de la traducción general. Este control permite reducir el estrés del RE mediante la reducción del número de proteínas mal plegadas [9]. Por otro lado, la fosforilación de eIF2α permite la transcripción de ATF4, un factor de transcripción que actúa sobre genes implicados en el metabolismo de aminoácidos, las respuestas frente a estrés oxidativo, la autofagia y la apoptosis [25].

ATF6

ATF6 (factor de transcripción activador 6) es una proteína transmembrana del RE que se localiza en células no estresadas. En las células sometidas a estrés RE, ATF6 es transportado al aparato de Golgi donde es escindido por las proteasas S1P y S2P para producir un fragmento citosólico soluble (ATF6f), que ingresa al núcleo para inducir la expresión de genes diana relacionados con ERAD y el plegamiento de proteínas como los genes que codifican para las chaperonas BiP. (9) [25].

Estas ramas de señalización de la UPR no se activan de forma simultánea, sino que la activación de ATF6α e IRE1α ocurre de inmediato y disminuye con el tiempo, mientras que la activación de PERK sigue a la de ATF6α e IRE1α y permanece durante el estrés crónico del RE.

En condiciones normales, BiP interactúa con los dominios luminales de estos transductores, actuando como regulador negativo de su activación. Ante el estrés del RE, BiP se une a las proteínas mal plegadas, lo que permite su liberación de los transductores. La liberación de BiP de IRE1 y PERK permite su homodimerización y activación, mientras que su liberación de ATF6 permite el transporte de éste al compartimento de Golgi para la proteólisis intramembrana regulada. Esta activación regulada por BiP proporciona un mecanismo directo para detectar la capacidad de plegamiento del RE. Además, las proteínas mal plegadas pueden actuar como ligandos activadores para estos sensores de estrés a través de la unión directa al dominio luminal de IRE1α y PERK.

Estos vías de transducción actúan como bucles de retroalimentación homeostática para atenuar el estrés del ER, de manera que, si tiene éxito en reducir la cantidad de proteína mal plegada, la señalización de la UPR se atenúa y la célula sobrevive.

Algunos factores ambientales, el envejecimiento y mutaciones genéticas puede dar lugar a un mal funcionamiento de la UPR, lo cual se ha demostrado que induce enfermedades relacionadas con el plegamiento anómalo de proteínas como diabetes, ateroesclerosis, neurodegeneración, inflamación y cáncer.

UPR terminal: hacia la muerte celular

Ante el estrés del RE prolongado, las respuestas adaptativas pueden resultar insuficientes para restaurar la homeostasis del plegamiento de proteínas, de manera que la UPR activa una vía de señalización alternativa proapoptótica, que induce la muerte celular para evitar la supervivencia de células aberrantes.

Aun no se conocen los detalles moleculares de esta vía, pero hay evidencias de que las dos quinasas UPR, PERK e IRE1α, involucran un conjunto de salidas pro-apoptóticas que conducen a la degeneración celular si el estrés del RE no se puede resolver (Figura 7) [10, 27]. 

La hiperactivación de PERK conduce a la pausa prolongada de la traducción de proteínas, debido a la fosforilación de eIF2α, lo cual es incompatible con la supervivencia. Además, PERK induce la transcripción de ATF4, que activa a su vez la transcripción de CHOP (proteína homóloga C/EBP), un factor de transcripción que media la muerte celular mediante la regulación de la expresión de varias proteínas:

• Inhibe la expresión de las proteínas anti-apoptóticas de la familia BCL-2, lo que conduce a la activación de proteínas BH3. Éstas desactivan las proteínas protectoras mitocondriales y las proteínas pro-apoptóticas BAX y BAK para que permeabilicen la membrana mitocondrial externa.
• Activa la expresión de ERO1α (ER oxidorreductina 1), que crea un entorno hiperoxidante en el RE, perjudicando el plegamiento de proteínas y, por tanto, aumenta la señal a favor de la muerte.
• Activa la expresión de GADD34 (proteína inducible por daño del ADN), que media la desfosforilación de eIF2α, de manera que se reanuda la síntesis de proteínas, aumentando la carga de proteínas en el RE. Por tanto, se forma un bucle de retroalimentación al amplificar la señal tóxica a favor de la muerte [28].

La hiperactivación de IRE1α fosforilada conduce a la formación de oligómeros en vez de homodímeros, lo cual tiene los siguientes efectos:

• Su dominio RNasa tiene afinidad por los sustratos RIDD (desintegración de ARNm dependiente de IRE1), actuando como una endonucleasa de cientos de ARNm localizados en ER, de manera que agota la carga de proteínas en el RE y los componentes de la maquinaria de plegamiento, empeorando aún más el estrés. 
• La actividad RNasa reduce los niveles de microARN que normalmente reprimen dianas pro-apoptóticas, como la proteína pro-oxidante TXNIP (proteína que interactúa con tiorredoxina), cuyo aumento activa el inflamasoma y una vía pro-apoptótica dependiente de Caspasa-1.
• Recluta TRAF2 (receptor 2 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral), que activa ASK1 (quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis). Ésta activa a su vez JNK (quinasa terminal c-Jun NH₂) y MAPK (proteína quinasa activada por mitógenos p38) que, mediante fosforilación, activan la BH3 pro-apoptótica e inhibe la BCL-2 anti-apoptótica [10, 27].

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El VIH o virus de la inmunodeficiencia humana es muy conocido por la mayoría de la población debido a que ocasiona el síndrome de la inmunodeficiencia humana (SIDA). En un primer momento, el SIDA fue relacionado con drogadictos y gays, gente que en aquella época era tratada como los desechos de la sociedad. Esta situación es recreada muy bien en el siguiente video, donde se cuenta la historia de cómo un linfocito infectado por VIH es repudiado por el resto pero finalmente los antirretrovirales hacen efecto y permite que este siga bailando junto a otro por el torrente.

Origen

El VIH es un retrovirus perteneciente a la familia de los lentivirus. Este tipo de virus proviene de un salto inter-especie del virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV). El VIH-2 (menos patogénico y transmisible) proviene de la variedad SIVsm (Sooty mangabey) y el VIH-1 (causante de la pandemia) a su vez lo podemos dividir en diferentes grupos: el VIH-1 de los grupos M y N proviene del SIVcpz (chimpancé) (1), mientras que el VIH-1 de los grupos O y P proviene del SIVgor (gorila) (2).

Dentro del VIH-1 grupo M encontramos diferentes subtipos a partir de los cuales mediante recombinación entre ellos se puede formar formas recombinantes circulantes. En Europa el subtipo que predomina es el subtipo B (3).

Morfología y ciclo biológico

El VIH es un virus esférico con una envoltura lipídica, donde se localizan las espículas, matriz y nucleocápside, donde encontramos dos cadenas de RNA. El genoma viral está compuesto por 9 genes (Gag, Pol, Env, Tat, Rev, Nef, Vif, Vpr, Vpu), cuya estructura aparece en la Figura 2 y cuyas funciones aparecen en la Tabla 1.

Para que se pueda llevar a cabo la infección y transmisión del VIH es necesario su integración en la célula del huésped. Primero es necesario la interacción con receptores CD4 (localizados en linfocitos T, linfocitos B, monocitos …) y posteriormente con correceptores CCR5 y CXCR4 (receptores con 7 dominios transmembrana), de tal forma que las partículas virales pueden tener tropismo por receptores CCR5, CXCR4 o ambos.

En un primer lugar, la proteína gp120, localizada en la zona exterior de las espículas de la membrana del virión interacciona con el receptor CD4, provocando un cambio de conformación en gp120 que deja expuesto a su dominio V3, para que se una a los correceptores (receptores de quimiocinas). Estos cambios a su vez provocan un cambio conformacional en la proteína gp41, que deja expuesto el péptido de fusión (N-terminal), el cual se ancla a la membrana plasmática provocando el acercamiento y finalmente la fusión de ambas membranas.

En el siguiente video representa el final del proceso mediado por gp41.

Este proceso está favorecido por las interacciones que se producen entre el VIH y las lectinas DC-SIGN y L-SIGN, localizadas en la superficie de las células dendríticas, provocando el aumento de la infección de los linfocitos circulantes. De esta forma, en las prolongaciones de las células dendríticas se facilita la infección de linfocitos CD4 (10).

Tras la fusión de las membranas se produce la entrada de la nucleocápside viral, para a continuación descapsidar el genoma viral. Este proceso es inhibido por la proteína celular TRIM5α (específica de cada especie), que provoca que cada retrovirus deba generar variantes de la proteína de la cápside para evitar la acción de estas proteínas celulares (11)(12).

Una vez que tenemos libre el RNA viral en el citoplasma, se produce la retrotranscripción, proceso en el cual interviene la transcriptasa inversa (TI). Para la retrotranscripción será necesario unos niveles de nucleótidos y factores celulares, lo cual implica que el linfocito esté activo, porque en caso de que se encontrase en reposo se produciría una retrotranscripción incompleta dando lugar a un DNA retrotranscrito parcial que se degradaría por nucleasas celulares. Por el contrario, en linfocitos activados, una vez que tenemos el DNA transcrito este se va a unir a factores virales (Vpr) y celulares formando el complejo de pre-integración localizado en el citoplasma.

Este complejo será transportado al núcleo para ser integrado mediante la acción de la integrasa en cualquier parte del genoma de la célula huésped (es más frecuente en secuencias intrónicas de genes que estén activados). Sin embargo, no todo el DNA viral será integrado, quedando un porcentaje que será susceptible de integración.

Una vez que ya se haya integrado el genoma viral, se pueden dar diferentes escenarios, en los que el VIH puede permanecer latente, replicarse de forma masiva o de forma controlada.

Para que se inicie la replicación es necesario que se produzca la transcripción, proceso que únicamente depende de factores celulares, entre los que podemos destacar el NF-κB (13) el cual no se encuentra activado en linfocitos en reposo y sí en linfocitos activados.

Una vez que se inicia la síntesis, la proteína Tat aumenta la tasa de transcripción  del RNA viral (es necesario para transcripción completa del RNA viral), el mRNA viral es transportado al citosol para ser procesado en transcritos de menor tamaño. Ambos procesos (procesamiento y transporte) están regulados por la proteína Rev (localizada en el núcleo), y si no hay Rev el mRNA viral se acumula en el núcleo. De esta forma obtenemos diferentes proteínas virales que serán procesadas para su posterior ensamblaje dando lugar a las partículas maduras. En este proceso es importante remarcar el papel del las proteínas Vif y Vpu.

Vif va a producir la degradación proteosomal de APOBEC3G (A3G) impidiendo su entrada en los viriones en formación. La acción que tiene APOBEC3G es producir la desaminación de citosina en la primera hebra retrotranscrita por la transcriptasa inversa, provocando mutaciones en el genoma viral que provocan su degradación o una hipermutación y posterior degradación. De esta forma los efectos de su acción se ven sobre los viriones (14).

Vpu actúa inhibiendo la expresión de Tetherina, de tal forma que permite y facilita la liberación de viriones de la célula al espacio extracelular, ya que la Tetherina actúa secuestrando los viriones recién formados en la membrana celular.

Finalmente se llevará a cabo la maduración final en el proceso de gemación mediante la acción de la proteasa viral sobre poliproteínas. Cabe destacar que el precursor gp160 (da lugar a gp120 y gp41) es procesado por la proteasa celular.

La transmisión del VIH principalmente se produce vía parenteral, vía sexual o vertical (transmisión madre-hijo).

Patogenia

El VIH una vez que se introduce en un organismo va a provocar principalmente un debilitamiento del sistema inmunitario, el cual estará muy relacionado con la disminución en el número de linfocitos T CD4+ (10). Esta disminución de linfocitos CD4 puede deberse a diferentes motivos que aparecen representados en la Figura 8.

La alteración en la homeostasis esta ocasionada por una acumulación de los linfocitos alrededor de prolongaciones de células dendríticas de los órganos linfoides donde se localizan las partículas víricas. A su vez la replicación vírica provoca un bloqueo en la generación de nuevos linfocitos por parte del timo y la médula ósea, dificultando la sustitución de los linfocitos destruidos por el VIH.

En la destrucción directa por efecto citopático, es importante destacar que la destrucción es preferentemente en aquellos linfocitos activados (tienen altos niveles de CCR5, altos niveles de nucleótidos, ATP… En definitiva, factores que son necesario para la replicación del virus).

En el sistema GALT (tejido linfoide asociado al intestino) hay un predominio de linfocitos CD4 activos (debido a que están en continuo contacto con partículas antigénicas). Esto provoca una gran destrucción del sistema GALT que es irreversible. A su vez, la destrucción de linfocitos activados también explica que se destruyan linfocitos de memoria, lo cual agrava la situación inmunológica. Finalmente, el proceso de activación y reconocimiento del VIH provoca la activación de linfocitos que reconocen y atacan las células infectadas, esto ocasiona que las células que iban a matar al VIH se activen siendo infectadas y destruidas. De esta forma, el VIH elimina de manera específica los linfocitos de memoria contra él, facilitando el escape viral ante la respuesta inmune.

Por otro lado, la destrucción indirecta de los linfocitos esta mediada principalmente por dos mecanismos. En primer lugar los linfocitos infectados por el VIH presentan péptidos virales en sus moléculas de HLA clase I siendo objetivos de linfocitos T CD8 citotóxicos.

En segundo lugar, se produce apoptosis, esta se puede dar por dos vías: extrínseca (unión a la membrana plasmática de citocinas de la familia del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa)) e intrínseca (alterando la permeabilidad mitocondrial). El VIH puede inducir dicha apoptosis mediante síntesis de citocinas por macrófagos y linfocitos, aumento de la expresión de ligandos citotóxicos o mediante el efecto tóxico de proteína virales. Por otro lado, se ha visto que la proteína Tat puede tener un papel antiapoptótico en linfocitos infectados.

Finalmente, la hiperactivación y el agotamiento vienen ocasionados por una sobreproducción de linfocitos que se puede ver en los linfocitos CD8 citotóxicos producidos frente al VIH, ya que carecen de la capacidad citolítica requerida, debido al agotamiento por la sobrecarga antigénica. A su vez, es fácil pensar que la activación constante del sistema inmune viene ocasionada por la carga viral. Sin embargo, se ha visto que en pacientes con carga viral indetectable y con tratamiento antirretroviral se sigue produciendo esa activación, esto es debido, a la activación de virus endógenos (SIDA) y al aumento de la translocación de productos bacterianos debido al daño producido en el sistema GALT.

Sumado al descenso de linfocitos CD4 ocasionado por la infección del virus es necesario destacar la inflamación crónica que se produce debido a la secreción de citocinas proinflamatorias secretadas por la activación desmesurada que sufre el sistema inmune ocasionando daño endotelial y tisular sistémico.

Esta acción esta favorecida por los diferentes mecanismos que tiene el VIH para evadir la respuesta inmune, los cuales están representados en la Figura 10.

La infección por VIH a su vez se puede dividir en diferentes etapas según avanza el curso de la enfermedad (10).

Una primera etapa o infección reciente. Si se tiene en cuenta que la forma de contacto con el virus ha sido por la vía sexual, el primer contacto que tiene el virus es con las células dendríticas y los linfocitos localizados en la vagina y el recto (sistema GALT), y de ahí se va a producir una diseminación a linfocitos circulantes y ganglios (la estancia en las mucosas es relativamente corta pronto se puede observar una viremia en sangre). A partir de la infección hay un lapso de 4-12 semanas durante el cual no hay respuesta del sistema inmune, lo que ocasiona un gran avance del virus que destruye gran cantidad de linfocitos CD4, provocando la destrucción de gran parte del sistema GALT, que ya no se recuperará y que facilitará la translocación microbiana. 

Una segunda etapa o infección crónica, la cual empezaría a las 12 semanas de la infección, donde se se empiezan a generar anticuerpos y linfocitos CD8 citotóxicos. Esto produce que haya un control de la viremia, pero a su vez favorece que se empiecen a producir variantes para escapar de la respuesta inmune. Durante esta fase, el sistema inmune se va debilitando provocando la aparición de alteraciones en la activación y maduración linfocitos CD8 y CD4.

Finalmente, hay una tercera etapa correspondiente a un estadio avanzado, que se caracteriza por la aparición de enfermedades oportunistas a causa de una bajada en el número de linfocitos CD4 y una elevación de la carga viral. En esta fase se ha podido observar un aumento en partículas virales con tropismo por los correceptores CXCR4.

Por lo tanto esta última fase se correspondería con la aparición del síndrome de la inmunodeficiencia humana (SIDA).

Tratamiento mediante ART

Inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de los nucleósidos y nucleótidos (ITIAN)

Son fármacos que inhiben transcriptasa inversa del VIH mediante una inhibición competitiva actuando como análogos. Su target farmacológico se localizará en el centro catalítico (situado en el subdominio de la palma en la subunidad p66). Se dividen en dos clases:

• Análogos de nucleósidos: Abacavir, emtricitabina, lamivudina y zidovudina.
• Análogos de nucleótidos: Fumarato de disoproxilo de tenofovir (16).

Análogos de nucleósidos

Actuarán como análogos estructurales de diferentes nucleósidos, pero diferirán de ellos, sobre todo en el radical del C 3´ de la desoxirribosa. Serán fosforilados por las mismas enzimas celulares que los nucleósidos con los que competirán.

Estos análogos de nucleósidos trifosforilados serán incorporados en el DNA viral perdiendo 2 fosfatos y quedando incorporados como análogos de nucleósidos monofosfato. Por tanto, se dará una competición entre estos fármacos y los nucleósidos trifosforilados para incorporarse en el DNA viral.

Las diferencias que poseen estos fármacos en el C 3´de la desoxirribosa impedirán la formación del enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido, deteniendo la elongación de la cadena prematuramente lo cual provoca la inhibición de la transcriptasa inversa (17).

Abacavir (sulfato de abacavir, ABC)

Este fármaco será un análogo estructural del desoxirribonucleósido de guanina. Diferirá de este en que el C 3´ de la desoxirribosa no poseerá un grupo hidroxilo, por lo que formará un doble enlace, además de diferentes variaciones en la guanina.

Emtricitabina (FTC)

Este fármaco será un análogo estructural de la desoxicitidina. Diferirá de este en que el C 3´ de la desoxirribosa será sustituido por un átomo de azufre, además de diferentes variaciones en la citosina como un radical de flúor.

Lamivudina (3TC)

Este fármaco será un análogo estructural del desoxicitidina. Poseerá la misma diferencia que posee la emtricitabina (átomo de azufre) pero no poseerá un átomo de flúor en la citosina.

Zidovudina (azidotimidina, AZT, ZDV)

Este fármaco será un análogo estructural de la timidina (desoxirribonucleósido de timina). Diferirá de este en que el C 3´de la desoxirribosa no poseerá un grupo hidroxilo, sino un grupo azida.

Análogos de nucleótidos: fumarato de disoproxilo de tenofovir (tenofovir DF, TDF)

Este compuesto en un profármaco que sufrirá diversas hidrolisis diestéricas hasta transformarse en tenofovir.

El tenofovir será un análogo estructural del desoxirribonucleótido de adenina (desoxiadenosina monofosfato). A diferencia de los análogos de nucleósidos, este compuesto solo sufrirá dos fosforilaciones por las mismas enzimas celulares que fosforilan el nucleótido de adenina.

El tenofovir difosfato será incorporado al DNA viral perdiendo 2 fosfatos y quedando incorporado simplemente como tenofovir. Por tanto, se dará una competición entre el tenofovir difosfato y la desoxiadenosina trifosfato por la incorporación.

El tenofovir poseerá una estructura química que diferirá de desoxiadenosina monofosfato ya que no poseerá una desoxirribosa como conector, sino que poseerá un metilisopropileter. Al no poseer la desoxirribosa, no poseerá su C 3´ y, por tanto, impedirá la formación del enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido. Esto supondrá la detención de la elongación de la cadena prematuramente provocando la inhibición de la transcriptasa inversa (16)(17).

Inhibidores de la transcriptasa inversa no análogos de nucleósidos (ITINN)

Estos fármacos inhiben la actividad polimerasa de la transcriptasa inversa del VIH-1. No necesitarán ser fosforilados ni se incorporarán a la cadena de DNA viral, como los anteriores, sino que realizarán una inhibición no competitiva uniéndose a la propia enzima.

Se dividen en dos generaciones:

• Primera generación: Efavirenz (EFV) y nevirapina (NVP): precisan pocas mutaciones para desarrollar resistencia.
• Segunda generación: Etravirina (ETR) y rilpivirina (RPV) utilizados contra cepas del VIH-1 resistentes a la primera generación (18).

Además de estas dos generaciones, en los últimos años, surge un fármaco de nueva generación llamado doravirina (DOR).

Se unirán en la transcriptasa inversa en un bolsillo hidrofóbico situado a 10-15 Å del centro catalítico de la actividad polimerasa y a 60 Å del sitio activo de la actividad ribonucleasa H.

Estos fármacos actúan contra el VIH-1 y no contra el VIH-2 debido a que los residuos 181 y 188 en la RT-VIH-1 son tirosina mientras que en la RT-VIH-2 son isoleucina y leucina, respectivamente. Esto provoca que no se pueda dar la unión del fármaco (19).

Los fármacos de primera generación (EFV y NVP) se unen a los residuos de tirosina (Y181 y Y188) localizados en la región de la palma. Por otro lado, los fármacos de segunda generación (ETR y RPV) se unen a otros puntos como un residuo de triptófano (W229), sitio en el que se producen menos mutaciones. Debido a esto, los fármacos de primera generación sufrirán más resistencia que los de segunda generación (18).

La unión a estos puntos provoca cambios en la conformación que provocan la inhibición de la catálisis del RNA viral y la formación de DNA viral disminuyendo la replicación del VIH-1.

Inhibidores de la proteasa (IP)

La proteasa se encarga de realizar la hidrolisis del enlace peptídico de las poliproteínas virales gag y gag-pol. En concreto, se tiene como consenso que en estas poliproteínas se da la hidrolisis del enlace peptídico entre fenialanina (posición 1) y prolina (posición 1´).

Estos fármacos inhibirán la proteasa del VIH y los clasificaremos según su modo de acción:

• Actuando como peptidomiméticos y compitiendo con las poliproteínas virales en la unión al centro activo (Asp25-Asp25´): Saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), fosamprenavir (FPV), atazanavir (ATV) y darunavir (DRV).
• Uniéndose a otra zona del centro activo (Ile50-Ile50´): Tipranavir (TPV).

Los diferentes sustituyentes que tendrán formarán interacciones con aminoácidos de la estructura de la proteasa produciendo más afinidad.

Cabe destacar que el ritonavir actualmente se utiliza como potenciador farmacocinético ya que inhibe el citocromo CYP3A4, el cual se encarga del metabolismo de estos fármacos. Por ello, este se administrará junto con otro IP (20).

Inhibidores de la integrasa

El dolutegravir (DTG) y el raltegravir (RAL) son fármacos antirretrovirales que actúan inhibiendo la integrasa. Pertenecen al grupo de los INSTI (inhibidores de la transferencia de cadenas de la integrasa).

La integrasa posee dos cationes metálicos divalentes (Mg ²⁺) en su sitio activo, en el cual se unirá al DNA del hospedador. Estos dos átomos metálicos serán el target farmacológico.

Se unen a los dos cationes divalentes en el sitio activo cuando la integrasa forma el complejo de preintegración. Esto provoca que la 3-desoxiadenina, que se encuentra en el extremo 3´del DNA viral, se desplace impidiendo la transferencia e integración del DNA viral al DNA del hospedador (21).

Inhibidores de la fusión

La proteína de fusión gp41 de los retrovirus posee dos regiones de repetición: HR1 y HR2. La HR1 forma una estructura de enrollamiento trimérica y HR2 se pliega dentro de los surcos hidrofóbicos de HR1 para formar una horquilla. En esto consiste el zapping de gp41. Esto provoca el acercamiento de las dos membranas y la formación de un poro de fusión.

Poseemos un único fármaco que inhiba este proceso el cual es la enfuvirtida. Este previene este proceso uniéndose a la región HR1 previniendo el zapping de gp41. La secuencia de aminoácidos de este fármaco es similar a la secuencia de HR2 provocando que realice el pliegue que realizaría HR2.

Se cree que esta acción se realiza después de que se una la proteína gp41 en la membrana de la célula y antes de que se realice el pliegue de HR2. Esto provoca la inhibición del zapping de gp41 y los sucesivos cambios conformacionales para que se dé la fusión (22).

Antagonistas de CCR5

Poseemos un único fármaco, el maraviroc (MVC). Este es un inhibidor alostérico del correceptor CCR5, que inhibe la entrada de retrovirus a la célula.

Es una imidazopiridina que se une a una región transmembrana de CCR5 (dominios transmembrana 2, 3, 6 y 7). Esto provoca una serie de cambios conformacionales, especialmente en el dominio ELC2, lo cual impide que la región V3 de la glucoproteína gp120 de la envuelta interaccione con el receptor (23). Esto impide que se dieran cambios conformacionales posteriores para que se insertara gp41 en la membrana celular provocando la fusión.

Inhibidores de la fijación: Fostemsavir

Fostemsavir es un profármaco del temsavir, el cual impedirá la fijación del VIH. Se unirá directamente a la proteína gp120 e inhibe la interacción entre el receptor CD4 celular y el virus. Por tanto, también inhibirá los procesos posteriores a la fijación impidiendo la entrada a linfocitos T CD4+ (24).

Inhibidores posfijación: Ibalizumab-uiyk

Ibalizumab es un anticuerpo IgG monoclonal humanizado el cual bloquea la entrada del virus a los linfocitos T4 sin deteriorar el sistema inmune. Es el primer anticuerpo monoclonal para el tratamiento del VIH y el primer inhibidor posfijación.

Se une al dominio 2 del receptor CD4 en la superficie opuesta tanto en el sitio de unión del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II como en el sitio de unión de g120 (25).

Tratamiento mediante CRISPR-Cas9

¿Qué es el sistema CRISPR-Cas9?

El sistema CRISPR-Cas9 ha evolucionado en procariotas como un sistema inmune de memoria que confiere a estos microorganismos resistencia a una segunda entrada de material genético exógeno, como aquel que puede ser introducido a través de fagos o plásmidos.

En el genoma bacteriano existe una región, el locus CRISPR (siglas de “Clustered regularly interspaced short palindromes repeats”, o “Agrupaciones de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas”), que porta porciones de RNA exógeno (de unos 20pb), perteneciente a fagos u otros elementos genéticos, insertadas por la propia bacteria cuando esta sobrevive a una infección. Estas porciones de RNA, denominadas “protoespaciadores”, se encuentran intercaladas entre otras secuencias cortas que se repiten.

Además, en este locus están también las secuencias que codifican para otros elementos formadores del sistema CRISPR-Cas9, como la enzima Cas9 (“CRISPR asociated protein 9”, una nucleasa) o el RNA transactivador de CRISPR (TracrRNA). La defensa frente un nuevo DNA “conocido” entrante por parte de la bacteria se basa en la complementariedad entre este y el protoespaciador específico (el fragmento de RNA que constituye ese protoespaciador recibe el nombre de crRNA) que se corresponde con ese material genético, además de la interacción de estos con el TracrRNA y la nucleasa Cas9, que desarrolla la acción de degradación del nuevo material genético infectante.

Este sistema, nativo de bacterias, ha servido de base para desarrollar en los últimos años un sistema de edición genética que puede ser usado para manipular y escindir partes concretas del DNA humano causantes de graves enfermedades, así como para prevenir y tratar diferentes enfermedades infecciosas como las causadas por el VIH, entre muchos otros agentes infectantes (26).    

La maquinaria que permite desarrollar este método de edición génica consiste en una enzima Cas9 unida a una porción de RNA denominado RNA guía (gRNA), formado por la conjunción de un TracsRNA y un crRNA que cuenta con un protoespaciador sintetizado artificialmente y de manera intencionada para que sea complementario de la región del DNA celular (secuencia diana) que se quiere modificar o escindir.

Además de la secuencia diana, para la unión de la proteína Cas9 (y para el correcto emparejamiento con el protoespaciador) es necesaria una secuencia PAM, de apenas 3 nucleótidos, situada junto a ella. Los dominios HNH (Histidina-Asparagina-Histidina) y RuvC de la nucleasa Cas9 participan en la unión de la enzima a la secuencia diana del DNA celular (aquellas con la que interacciona el protoespaciador) y a la hebra complementaria a la secuencia diana, respectivamente (9)(27).

Una vez se ha producido el corte en el DNA celular, el proceso puede continuar con la reparación de las hebras mediante recombinación homóloga o no homóloga. A través de la primera, gracias a un DNA donador, se puede introducir nueva información genética.

Sin embargo, si el proceso desarrollado por el sistema CRISPR-Cas9 no se acompaña por ningún DNA donador y se produce la recombinación no homóloga (unión de los extremos no homólogos formados en el DNA tras el corte), el resultado será un knock-out del gen afectado, un gen no funcional, pues simplemente se ha anulado la función del gen y no se ha introducido nueva información genética.

DNA provirus en latencia en linfocitos T CD4+ como diana del sistema CRISPR-Cas9 para el tratamiento por VIH

Por lo general, la terapia antirretroviral (ART) para tratar el SIDA es capaz de controlar la viremia de manera efectiva, pero no consigue eliminar el virus presente en estado de latencia en los linfocitos T infectados. Durante el estado de latencia, las células infectadas por el VIH apenas generan productos víricos, lo que les permite evitar el ataque del sistema inmune del hospedador y, por tanto, permanecer en él durante larguísimos periodos de tiempo.

En estos linfocitos T CD4+ de memoria (cuando se encuentran en un estado de descanso (“a memory resting state”), algo normal tras producirse la infección de estas células por parte del virus), las copias inactivas del provirus (se denomina así al DNA viral resultante de la retrotranscripcción que se encuentra integrado en el genoma celular ) pueden reactivarse cuando lo hicieran las células en las que se encuentran y causar un nuevo rebrote si el tratamiento antirretroviral se interrumpe (28).

Debido a que se cree que estas células son los principales “almacenes” de DNA viral en estado de latencia (29) se han convertido en el objetivo de los principales tratamientos contra el SIDA basados en la utilización del sistema CRISPR-Cas9.

Escisión del provirus del genoma de linfocitos T CD4+ de memoria

En la siguiente tabla aparecen algunas secuencias diana del provirus sobre las que se puede actuar a través del sistema CRISPR-Cas9, así como los métodos de introducción de los elementos necesarios (gRNA y nucleasa Cas9) para desarrollar la técnica (9).

En diferentes estudios, se consideró la posibilidad de provocar la eliminación de las células hospedadoras del virus en estado de latencia a través de su reactivación, pues esto provocaría una respuesta inmune contra ellas que conllevaría también la eliminación del virus (28). Sin embargo, debido a diversos inconvenientes, consideraron mejores como cura métodos que eliminasen directamente el genoma del virus de las células hospedadoras, como es el caso del método de edición genética CRISPR-Cas9.

En su estudio, Kaminski et al. (28) utilizaron el algoritmo de secuenciación CREST (clipping reveals structure) (38) para la localización de alteraciones estructurales en el genoma de células de la línea de células Jurkat 2D10. Se encontraron cuatro puntos de rotura en el DNA de la célula hospedadora en los cromosomas 1 y 16, concretamente en las regiones p13.2 y p13.3, respectivamente.

Mediante una amplificación de corto alcance se encontró un fragmento de 504 nucleótidos correspondiente a la unión de las regiones 5’ LTR (Long Terminal Repeat) y 3’ LTR del genoma viral tras la acción del sistema CRISPR-Cas9 con un gRNA denominado B. Esta secuencia era 7 nucleótidos más larga que la secuencia de 497 nucleótidos amplificada en las células de control, pues se había producido, además, una inserción de un fragmento de 7 nucleótidos.

La acción del sistema CRISPR-Cas9 / gRNA B permitió eliminar el genoma viral, pues no se pudo secuenciar la región de 257 pares de bases correspondientes al elemento de respuesta Rev (RRE), que se encuentra en el centro de este.

Examinaron mediante PCR de alto rango las posiciones en las que se inserta el genoma viral dentro de los cromosomas 1 y 16. En ambos, se obtuvieron tres tipos distintos de amplicones: uno de larga longitud (de 6130 pb para el cromosoma 1 y de 5467 pb para el 16), correspondiente al genoma integrado del VIH-1 más su secuencia de ADN flanqueante derivado del cromosoma; uno de tamaño medio (de 909 pb y de 759 pb, respectivamente), que se corresponde con el mismo fragmento pero tras escindir por completo el genoma viral; y otro mucho menor (de 264 pb y 110 pb), que se trata del fragmento de DNA correspondiente del cromosoma homólogo, que no ha sufrido modificación alguna.

Revisiones posteriores del método determinaron que el genoma viral escindido es mayoritariamente degradado a continuación, por lo que el riesgo de transposición o reintegración en el genoma del huésped es bajo (28).

Escape viral al tratamiento y como consecuencia del tratamiento

Sin embargo, según otros estudios, como se recoge en la publicación de Das, Binda and Berkhout (39), es posible que el virus escape a la inhibición mediante mutaciones efectuadas en la región del genoma viral que es diana del corte efectuado por Cas9 que impidan su acción pero permitan la replicación viral. Entre estas mutaciones se encontraron indels (inserciones o deleciones) en regiones poco conservadas (promotores de la región LTR) y sustituciones e inserciones en regiones conservadas, como dominios que codifican para proteínas, lo que constituye un patrón de mutaciones diferentes al que ocurre para escapar de los fármacos ART.

El origen de esas mutaciones puede encontrarse, además de en el proceso de retrotranscripción desarrollado para integrar el genoma viral en el genoma de la célula hospedadora, en el proceso de modificación del genoma proviral desarrollado por parte del propio sistema CRISPR-Cas9.

Infectividad por VIH de células T tratadas con el sistema CRISPR-Cas9

En el mismo estudio (28) se probó cual era la reacción a la reinfección de clones de células T de las que se erradicó el genoma viral mediante el sistema con CRISPR-Cas9. Estas células contaban con diferentes componentes del sistema (unas con la enzima Cas9 en distintos niveles de concentración, otras con el gran y otras con ambos).

Los resultados fueron la resistencia a la reinfección por parte de aquellas células que contaban con ambos elementos (mayor resistencia en las que la expresión de Cas9 era mayor), pero no en las que solamente poseían uno de los dos elementos del sistema.

Otras dianas para el tratamiento del SIDA mediante terapia génica: Correceptores CCR5 y CXCR4

Además de tener el genoma proviral como diana para el tratamiento genético del VIH, el sistema CRISPR-Cas9 puede ser utilizado para bloquear la entrada del virus en los linfocitos T CD4+ a través de la modificación génica de los correceptores de membrana que empleados por el VIH para acceder al interior celular (9).

Simulando la resistencia al VIH que aparecen de manera natural en personas que presentan deleciones en gen que codifica para el correceptor CCR5 (40), el método CRISPR-Cas9 puede ser utilizado (como corroboran múltiples estudios, recogidos en el artículo de Xiao et al.) con la intención de editar los genes de los correceptores CCR5 y CXCR4 para evitar la infección por VIH sin que se pierda la función propia.

Ventajas y limitaciones de la utilización del sistema CRISPR-Cas9 como tratamiento contra el SIDA

La utilización del sistema de edición genética CRISPR-Cas9 se ha antepuesto a otros, como el uso de nucleasas con dedos de zinc (ZFNs) o de nucleasas que actúan como activadores transcripcionales (TALENs), debido al alto coste y tiempo requerido por los mismos. Entre los motivos que llevan al sistema CRISPR-Cas a ser el más ampliamente utilizado están su precisión, su sencillez o su alta eficacia (9).

Por otro lado, uno de los mayores inconvenientes que aparecen a la hora de utilizar el sistema CRISPR-Cas9 es el método de “aporte” o “liberación” (delivery) de los elementos que lo componen en las células infectadas. Entre los métodos comúnmente utilizados se encuentran los vectores adenovirales, vectores de AAV (virus adenoasociados, que requieren la coinfección con adenovirus) o los vectores lentivirales (41), en función de los requerimientos de expresión o el tamaño del material genético que se quiere introducir en el interior celular. También se puede llevar a cabo la transfección directa de los componentes del sistema (procedentes de, por ejemplo, Streptococcus pyogenes o Staphylococcus aureus) tras electroporación (42) o utilizando vesículas generadas artificialmente para permitir el transporte hasta el interior celular (43).

Además, como se comentó anteriormente, otra desventaja de este método es su alta especificidad (su precisión se le puede volver en contra), pues le da al virus la posibilidad de escapar y hacerse resistente al sistema mediante simples mutaciones en su secuencia.

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Ana Paola Cano Morris, María del Rosario García Sánchez, Luna Guerra Núñez. Biología Sanitaria, UAH.

Índice

¿Qué son los miRNA?

¿Cómo se forman?

¿Cómo funcionan?

Transporte de miRNA

miRNA en el ámbito clínco

Conclusión

Bibliografía

¿Qué son los miRNA?

Los microRNA son cadenas pequeñas de RNA no codificante formadas por unos 22 nucleótidos, que intervienen en la regulación de RNA. Al tener de diana a gran parte de los transcritos codificantes de proteínas, los miRNA están involucrados en casi todos los procesos patológicos y de desarrollo de organismos.

Algunos estudios plantean la hipótesis de que los miRNA provienen de una evolución de RNAs pequeños en eucariotas para suprimir material genético y transcritos no deseados.

¿Cómo se forman?

La mayoría de los miRNA son transcritos en el núcleo por la RNA polimerasa II como intrones o exones de RNAs no codificantes, siendo por tanto, su expresión regulada por factores de transcripción o reguladores epigenéticos. Como resultado se generará un primiRNA de unas 1000 bases que deberá sufrir una maduración hasta ser un miRNA funcional.

En estas secuencias aparecen pequeñas horquillas de unos 33-35 pares de bases en cuyos extremos hay un bucle y segmentos de cadena simple 5′ y 3′ que unirán las diferentes horquillas.

En el comienzo de la maduración participa la proteína Drosha, una endonucleasa RNasa-III cuya acción es sobre RNA de cadena doble, es decir, actuará directamente sobre la horquilla formada anteriormente. También colabora en este punto el cofactor DGCR8, cuya actividad principal es aumentar la interacción del Microprocesador que forman con el primiRNA.

Es importante que el tamaño de la horquilla sea regular para una correcta maduración. Este Microprocesador realiza un corte sobre el RNA de doble cadena aproximadamente a 11 pares de bases de la unión basal (lugar en el que comienza la doble cadena) y a 22 de la unión apical (lugar donde se sitúa el loop terminal de la horquilla). Si como hemos dicho antes, la horquilla tiene un tamaño de entre 33-35 pares de bases, el Microprocesador realizará un corte en el sitio correcto y se formará un premiRNA; este corte no es perfecto, sino que deja en el extremo 3′ dos nucleótidos de más que quedan desapareados. Es importante que esta nueva molécula también tenga en su extremo 5′ un monofosfato; ambas estructuras permitirán la correcta interacción con el resto de proteínas. El Microprocesador es susceptible de modificaciones que regulen tanto su expresión como su función, pudiendo ser la formación de miRNAs regulada en múltiples puntos.

Una vez formado el premiRNA el resto de su maduración se realizará en el citoplasma. El exporte de la molécula es llevado a cabo por la proteína Exportina 5 (EXP5), que reconoce la estructura del RNA de doble cadena e interacciona con el saliente en su extremo 3′. Se forma un complejo en forma de canasta con la proteína RAN-GTP y el premiRNA que interacciona con el poro nuclear. El GTP es hidrolizado después de la translocación del complejo, de forma que este se desensambla y el premiRNA queda libre en el citoplasma. En algunos tumores la proteína EXP5 está truncada por una mutación en el gen que la codifica, impidiendo la maduración de miRNAs.

En el siguiente paso de la maduración, interviene la proteína Dicer acompañada de la proteína TRBP que aumenta su eficacia. Dicer, al igual que Drosha, es una endonucleasa RNasa III cuya función es realizar un corte en el premiRNA cerca del loop terminal de la horquilla. Así se liberará una corta cadena de RNA duplexo de unos 22 pares de bases, que será el futuro miRNA. La proteína Dicer necesitará de los extremos 5′ fosforilado y 3′ desapareado para su correcta interacción y funcionamiento.

La pequeña doble cadena de RNA se asocia a continuación con a proteína AGO, formando el complejo silenciador inducido por RNA (RISC). Será otra vez necesario que los extremos 5′ y 3′ estén correctamente formados para una apropiada interacción con la proteína. Para la carga del miRNA en la proteína AGO, es necesaria la formación un complejo intermedio denominado RLC compuesto por el miRNA, la proteína Dicer explicada antes y la nueva AGO. En humanos existen hasta 4 tipos de la proteína AGO, pero se unen indistintamente a los miRNAs para la formación del complejo.

Por el momento seguimos teniendo el miRNA como una cadena doble, por lo que debemos referirnos al complejo como pre-RISC. Por último, se deberá eliminar la cadena que no vaya a funcionar como guía en el complejo por medio de la endonucleasa C3PO, teniendo ya así el complejo RISC con un miRNA funcional. La selección de la cadena guía se realiza en función de la estabilidad termodinámica de los extremos de la cadena, normalmente es elegida la que posee un extremo 5′ menos estable; la cadena descartada será rápidamente degradada (será una pequeña cadena de RNA sin ningún tipo de protección). No siempre es elegida la misma cadena, ya que existe cierta preferencia hacia una de ellas en un 96-99% de los casos. La cadena de miRNA menos frecuente, aún siendo también activa, será menos efectiva y aparece señalada como miRNA*.

Se acaba de explicar el funcionamiento de la biogénesis de miRNA de forma canónica. Por el contrario, no es la única vía y existen otras vías alternativas. Destacaremos los mirtrons, los cuales se forman desde los intrones de mRNAs inmaduros y también forman una horquilla; producto del splicing que sufren los mRNA en su maduración. Estas secuencias de RNA serán similares a premiRNA y se introducirán en el proceso de síntesis de miRNA habiéndose saltado el procesamiento por Drosha y DGCR8.

¿Cómo funcionan?

Como se ha adelantado antes, la complementariedad de bases entre el complejo RISC y el mRNA a regular es crucial para que el miRNA pueda llevar a cabo su función. La regulación del producto codificado por el mRNA en cuestión puede llevarse a cabo por dos vías:

• Degradación del mensajero
• Represión de la traducción

Ambas dependerán en el grado de complementariedad al que se llegue entre el miRNA y el mRNA.

Principalmente interactúan los nucleótidos de 2-8 del miRNA, altamente conservados, en el extremo 5’ (conocida como secuencia “seed”) con la región 3’UTR del mRNA, aproximadamente 15 nucleótidos después del codón de paro y junto a una secuencia rica en AU. Actualmente se sabe que la secuencia diana puede también encontrarse en la región codificante (ORF) o 5’UTR, aunque menos frecuente y eficaz que la unión canónica.

Que sean esos nucleótidos presentados al mRNA no es algo casual, viene determinado por la disposición del complejo RISC que consigue presentar este fragmento concreto de la cadena guía en forma de hélice A, lo que aumenta la afinidad y especificidad con el mRNA. Se ha estudiado que un segmento mayor supondría un problema para la unión, mientras que uno menor no tendría la especificidad suficiente para su buen funcionamiento.

El miRNA debe estar totalmente cubierto por la proteína AGO para evitar su degradación por RNasas. Solo se muestra la secuencia “seed” que se unirá específicamente al mRNA. En este punto ocurre la represión de la traducción. Existen varias hipótesis sobre este mecanismo:

• Ralentización o paralización de los ribosomas en un punto posterior a la iniciación de la traducción.
• Marcaje del polipéptido para su posterior degradación
• Prevenir la interacción entre el promotor y su activador traduccional

Para que ocurra la degradación del mRNA es necesario alcanzar un grado mayor de complementariedad con el miRNA. Después de la unión típica del extremo 5’ hay un cambio conformacional del complejo que permite extender la interacción en las regiones central y 3’ de la cadena, después la proteína AGO vuelve a su conformación típica. Es en este momento cuando puede ocurrir la degradación, realizándose un corte entre los nucleótidos 10 y 11. Es la proteína AGO quien posee una actividad endonucleolítica capaz de realizar el corte. Los fragmentos del mRNA serán posteriormente degradados, mientras que el miRNA permanece intacto para poder seguir actuando.

En eucariotas, los complejos RISC se encuentran principalmente asociados a Cuerpos P, zonas electrodensas donde se acumulan enzimas implicadas en la degradación de mRNA, siendo así considerado un lugar para la regulación postranscripcional de mRNA.

Se sabe que existe una función cooperativa de los miRNA ya que aparecen múltiples sitios de unión a estas moléculas en los mRNA, multiplicando así las respuestas de cada sitio de unión trabajando por si mismo. De esta forma el mecanismo de acción es más sensible a cambios en los niveles de miRNA. Los miRNA que se unieran al mismo mRNA también podrían ser distintos, debiendo tener en cuenta todas las interacciones a la hora de determinar una patología o tratamiento.

Los miRNA normalmente no tienen un mensajero diana determinado, sino que pueden regular la expresión de varios genes. Esto es posible en primer lugar, gracias a la conservación de los sitios de unión en las regiones 3’UTR de modo que aparecen compartidos entre una familia de genes. Por otra parte, la complementariedad entre la región 3’UTR y el miRNA no es completa en la mayoría de casos, sino que solo se da en una pequeña secuencia de 7 nucleótidos, lo suficientemente corta como para poder estar en otros mRNA.

Transporte de miRNA

Tan importante como conocer su funcionamiento en el interior celular, es conocer su transmisión entre diferentes células. Dependiendo de los mecanismos de transporte intercelular que utilicen, su transmisión tendrá características diferentes, las cuales afectaran a los procesos fisiológicos y patológicos. En el caso de estos últimos, determinaran la capacidad de diseminación y extensión de la enfermedad en el organismo.

Las principales vías de comunicación intercelular son: la señalización dependiente de contacto célula-célula (uniones intercelulares), la señalización mediante moléculas solubles y la señalización mediante vesículas extracelulares.

En el caso de los miRNA se ha demostrado su transmisión mediante: microvesículas, HDL, lipoproteínas, riboproteínas, cuerpos apoptóticos, exosomas y gap junctions. Estos dos últimos procesos serán los que explicaremos en profundidad debido a la gran importancia que están teniendo en las últimas investigaciones sobre miRNA.

Gap-junctions

Son microdominios de la membrana plasmática de células adyacentes, en los cuales se encuentran conexinas (en los invertebrados se denominan inexinas) formando canales proteicos que permiten un intercambio rápido de sustancias entre ambas células mediante el transporte directo de moléculas de pequeño tamaño.

Diversos estudios han demostrado la existencia de un trasporte de miRNA desnudos, es decir, sin el complejo RISC. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo molecular de dicho transporte.

Exosomas:

Los exosomas fueron descritos por primera vez por Pan y Johnstone en 1983. Son vesículas extracelulares de entre 40 y 120 nm de diámetro constituidos por una bicapa lipídica. Pueden transportar moléculas como: lípidos, proteínas, RNA… Además, se han detectado en la mayoría de líquidos corporales, lo cual los convierte en potenciales biomarcadores para ciertas enfermedades.

La biogénesis de los exosomas se produce siguiendo el siguiente proceso: Primero se forman endosomas tempranos a partir de la invaginación de la membrana celular. Seguidamente, se generan invaginaciones de la membrana del endosoma, dando lugar a múltiples vesículas intraluminales (ILVs), lo que resulta en la formación de cuerpos multivesiculares (MVBs). El contenido es seleccionado e introducido en las ILVs, que cuando sean secretadas al exterior celular por exocitosis, pasarán a considerarse exosomas.

El mecanismo para la introducción de los miRNA en los exosomas aún no está completamente estudiado y descrito, siendo necesaria una mayor investigación en ese campo. Las cuatro vías que vamos a exponer a continuación han sido descritas en diversos estudios y actualmente son la principal hipótesis para explicar dicho proceso.

MiRNA en el ámbito clínico

Fallos en la regulación de la expresión y la función de los miRNA, ya sea por alteraciones genómicas o cambios en su biogénesis, han mostrado ser factores importantes en el desarrollo y la progresión de múltiples enfermedades.

Los miRNA son por lo tanto, un área de estudio importante para futuras técnicas de diagnóstico y tratamiento.

MiRNA como biomarcadores

Los miRNA tienen el potencial de ser el biomarcador perfecto; se expresan de forma ubicua, se pueden aislar fácilmente y cuantificar con gran sensibilidad y especificidad en tejidos o fluidos. Además, son estables, tienen especificidad celular y relevancia fisiológica en estados patológicos.

Sin embargo, aún no se logra una estandarización en cuanto a su análisis, y la expresión y función de los miRNA ha presentado variabilidad en distintas poblaciones.  

Los principales test de diagnostico en el mercado son útiles para distintos tipos de cáncer y enfermedades relacionadas con la edad, esto mediante el análisis de varios miRNA. Aun así, hay proyectos en desarrollo que se centran en los niveles de un único miRNA. 

En los últimos años, muchos estudios han propuesto el uso clínico de los exosomas con miRNA como posibles biomarcadores para la detección y seguimiento de enfermedades en las que participan. Esto se debe a las siguientes características de los miRNAS exosomales:

• No todos los miRNA son transportados por exosomas.
• Algunos miRNA solo han sido detectados en exosomas en estados patológicos.
• Se han detectado diferencias en los niveles de secreción de exosomas con miRNA, además de una diferente concentración de estos en su interior, tanto entre estado fisiológico normal y estado patológico, como en la evolución de la enfermedad.

Ante estos resultados, el departamento de Hematología/Oncología del Hospital Pediátrico Bambino Gesù ha propuesto el análisis de los miRNA exosomales mediante RT-qPCR para la detección del cáncer infantil y un mejor seguimiento del progreso de la enfermedad, además de su reacción a los diferentes tratamientos.

MiRNA como terapia

Debido a sus patrones de expresión y su habilidad de unirse a varias dianas, usualmente en un mismo proceso biológico, los miRNA pueden potencialmente regular la expresión de múltiples elementos en rutas de señalización conocidas por estar afectadas en determinados estados patológicos. 

Sin embargo, la baja especificidad de unión, aumenta el peligro de efectos secundarios importantes producto de la afectación de otras rutas fuera de la diana deseada.

Es indispensable así el desarrollo de herramientas que permitan una predicción más exacta de la unión miRNA – mRNA, validando su uso terapéutico.

MiRNA “mimics” y “AntagomiRs”

Distintas patologías se caracterizan por alteraciones en la expresión de miRNA; tanto sobreexpresión como infraexpresión. Es por ello que las terapias basadas en miRNA, buscan principalmente aumentar o reducir los niveles de un miRNA especifico, según sea el caso.

Infraexpresión de miRNA;

Para aumentar los niveles de un miRNA especifico, se utilizan “mimics” de miRNA. Son moléculas sintéticas de RNA que presentan la misma secuencia que el miRNA endógeno, pudiendo restablecer así los niveles y función normal de este.

También se utilizan “Short hairpin RNAs (shRNAs)”; moléculas sintéticas que son procesadas de forma endógena para dar miRNAs maduros. Los shRNAs han mostrado minimizar la toxicidad y permiten sintetizar varios miRNAs a partir de un solo promotor.

En cáncer, la mayoría de miRNAs se encuentran infraexpresados, muchos de estos regulan el ciclo celular y se consideran supresores de tumores, por lo que restablecer sus niveles puede complementar o potenciar la eficacia de otros tratamientos oncológicos.

Sobreexpresión de miRNA;

Para inhibir la función de un miRNA que se encuentra sobreexpresado, se utilizan “AntagomiRs”; moléculas sintéticas que se unen al miRNA endógeno, bloqueándolo y regulando su expresión.

Otra forma de inhibir la expresión de miRNAs, es utilizando sitios de unión competitivos. Estos sitios de unión suelen ser “Antisense oligonucleotides (ASOs)”. Estos ASOs se modifican para aumentar su resistencia a la degradación por nucleasas, su unión a proteínas plasmáticas, su complementariedad con el miRNA diana y su habilidad para activar el sistema inmune innato. Lo que tiene como resultado que los miRNAs tendrán mayor afinidad por estos ASOs sintéticos que por sus ARNm complementarios, viéndose inhibida su función.   

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Ignacio Moratilla Rivera y Miryam Muñoz Martín

3º Biología Sanitaria

Introducción:

Si pensamos en degradación de materiales en la célula en general, siempre nos viene a la cabeza los lisosomas como máximo exponente de esta función. No vamos a negar su imprescindible papel en las células, pero tampoco es el único responsable de realizar estas funciones.

Existe otro sistema que es el responsable de la degradación de proteínas citosólicas contribuyendo a la proteostasis celular. Este sistema está constituido por unas pequeñas proteínas denominadas ubiquitinas y unos complejos proteicos conocidos como proteosomas. Ambos junto a otras enzimas constituyen un proceso en cadena en el que finalmente las proteínas serán degradas.

Este mecanismo no solo se va a limitar a la eliminación de proteínas mal plegadas o aberrantes, sino que también va a desempeñar un papel crucial en la regulación del ciclo celular y fallos en él pueden llevar a cataclismos fisiológicos serios como el Parkinson, Alzheimer o enfermedades cardiovasculares.

Ubiquitinas: las proteínas omnipresentes.

Las ubiquitinas son unas proteínas monoméricas que se encuentra presenten en todos los organismos eucariotas (de ahí su nombre, ya que son ubicuas). No se han encontrado en procariotas, pero tienen proteínas con motivos estructurales similares, ThiS y MoaD que son sus posibles antecesores. Una evidencia de ello son las dos glicinas del extremo C-terminal, que están presentes en estas proteínas y en las ubiquitinas.

• 

Lo que más llama la atención es su alto grado de conservación, lo que pone en evidencia su importante papel dentro de la célula. Presentan 76 residuos de aminoácidos, y el ser humano solo se diferencia en 3 de estos con las levaduras.

Estas pequeñas proteínas pueden ser vistas como “chivatas” ya que marcan por unión covalente las proteínas que deben ser degradas en proteosomas.

El residuo que produce la unión es una Gly situada en el extremo C-terminal y que es común en todas las ubiquitinas. La glicina se une a la proteína diana por un enlace isopeptídico, que se diferencia del enlace peptídico en que uno de los grupos (sea NH₂ o COOH) forma parte de un grupo R. En este caso ocurre entre en el grupo COOH de la Gly terminal con el grupo NH₂ de la cadena lateral de una Lys de la proteína diana en gran número de ocasiones, pero también se ha visto que pueden unirse con grupos tiol de la Cys y grupos hidroxilo de Ser y Thr.

Las ubiquitinas no actúan solas en los procesos de marcaje de las proteínas a degradar, sino que estás se unen unas con otras formando cadenas. A este proceso se le conoce como poliubiquitinación y es clave para el reconocimiento de la proteína en el proteosoma. En la formación de la cadena cada eslabón de unión está formado por una Lys de la ubiquitina proximal y la Gly C-terminal de la distal. 

A parte de las ubiquitinas, dentro de la célula podemos encontrar unas proteínas muy similares denominadas modificadores similares a ubiquitinas o Ubl (ubiquitin-like modifer proteins). Estas a parte de tener mecanismos comunes de unión con Lys, las Gly C-terminal y producir modificaciones en las proteínas, tienen un plegamiento casi idéntico al de la ubiquitina. 

Proceso en cadena: E1, E2 y E3.

Hasta que la ubiquitina llega a marcar la proteína a degradar, tienen que actuar una serie de enzimas que la activen y unan. 

E1: ubiquitina activasa

Esta proteína es la responsable de activar la ubiquitina mediante la unión a su extremo C-terminal de un residuo de cisteína (enlace tioéster). Para la formación de este enlace se requiere de ATP, que forma un intermediario con la ubiquitina antes de unirse a la enzima. La reacción de adenilación está muy conservada ya que se ha visto también en la proteína MoaD de bacterias.

El intermediario Ub-AMP se sitúa en el centro activo de la E1, cerca de donde se encuentra la cisteína de unión. La estructura del nucleótido se estabiliza por puentes de hidrógeno con la enzima E1, reduciendo la entropía y favorecer el proceso de formación del enlace tioéster. 

E2: enzima conjugadora

Las E2 unen las ubiquitinas que se habían unida a E1 también con un enlace en un residuo de cisteína. 

No es una única enzima E2, sino que son varias cada una con diferentes funciones. Estas después serán reconocidas por diferentes. El papel que puede tener E2 se discute, ya que podría ser más sencillo que E3 ligue directamente la ubiquitina desde E1 hasta la proteína diana. 

Como es habitual, los eucariotas preferimos darle un vuelta de tuerca a todos los procesos moleculares. La presencia de E2 constituye un punto de regulación importante en la ubiquitinación y en la especificidad de los sustratos que se etiquetan. 

La cisteína de E2 se encuentra en una hendidura de la estructura en la que debe entrar el complejo E1-Ubq para que se produzca la transferencia de una a otra.

E3: ubiquitina ligasa

La E3 tiene la habilidad de tomar la ubiquitina de la E2 y transferirla a la proteína diana. ¿Quiénes pueden ser estas proteínas dianas? Pues una gran diversidad de ellas. Es posible gracias a la existencia de varias enzimas E3 capaces de unir la ubiqutina a diferentes sustratos. 

Dicha unión ocurre entre el C-terminal de la ubiquitina y una lisina de la proteína a degradar. Pero tienen la función también de enlazar unas ubiquitinas con otras para formar cadenas de poliubiquitinas.

Las tres clases de ubiquitina ligasa existentes se diferencian en función de su dominio activo: RING finger, HECT y U-box. Dentro de cada clase a su vez existen subclases, esto permite incrementar la especificidad del reconocimiento de las proteínas que queremos ubiquitinar. Para ello cada tipo de E3 cuanta con dominios de reconocimiento hacia determinadas proteínas y hacia diferentes tipos de E2.

RESUMEN DEL PROCESO ENCADENADO

Proteosomas: toneles de degradación

El sistema del proteosoma de ubiquitina (UPS) es un complejo multiproteico muy conservado que se encarga de la degradación enzimática de las proteínas. Está formado por una partícula o core central 20S. Este núcleo presenta dos anillos exteriores, con siete subunidades alfa, y dos anillos interiores con siete subunidades beta. Tiene forma de barril, en cuyo interior hay seis centros activos con actividad proteasa. El extremo amino-terminal de las subunidades alfa pueden abrirse para favorecer el paso de la proteína al interior del proteosoma.

Además de la partícula central 20S, presenta partículas reguladoras 19S, compuestas por una tapa y una base. Esta última presenta seis moléculas de ATPasa, cuyos extremos carboxi-terminales encajan entre las subunidades alfa, provocando en ellas el cambio conformacional que abre la compuerta.

La ubiquitinación de las diferentes lisinas de las proteínas desencadena diferentes funciones, desde degradación de proteínas, hasta señales para reparar el DNA, activación de factores de transcripción, endocitosis…

En el proceso de liberación de aminoácidos de la proteína se distinguen dos partes, según la utilización de energía metabólica: hay una parte del proceso que es dependiente de ATP, mientras que otra parte es independiente de ATP. 

Las proteínas son desplegadas por reguladores mediante cambios conformacionales provocados gracias a la hidrólisis de ATP. Después, las proteínas desplegadas son traslocadas a los centros activos con actividad proteasa del núcleo central, dando lugar a pequeños péptidos de tres a quince aminoácidos. Por último, estos péptidos son degradados de forma independiente de ATP por endopeptidasas, carboxipeptidasas y aminopeptidasas.

Comprender la estructura y el funcionamiento del proteosoma ha permitido conocer su asociación con enfermedades cardiovasculares, diabetes, enfermedades neurológicas y cáncer. El gen que codifica el proteosoma se localiza en el cromosoma 6, cerca de la región donde se codifican las moléculas del MHC-II.

En la actualidad, se han descrito cuatro tipos de proteosomas:

• Proteosoma constitutivo, clásico o proteosoma 26S. 

Es una estructura grande, macromolecular y multiproteica que tiene carácter enzimático. Se localiza principalmente en el citosol, aunque también en el núcleo de todos los eucariotas, por lo que es el principal complejo proteolítico celular, además, es la misma vía que la célula usa para presentar los péptidos en la superficie en el contexto de MHC-I. 

Reconoce los sustratos de modo dependiente de ubiquitina, de modo mediado por un adaptador y de manera independiente de ubiquitina, en las tres formas requiere de ATP, siendo la vía dependiente de ubiquitina la más usada por microorganismos eucariotas.

• Inmunoproteosoma

Fue descubierto en células WEHI-3 al ser tratadas con IFN-gamma. Se localiza en las células dendríticas de la médula del timo y en las células epiteliales tímicas medulares. 

Se observó que presentan baja actividad tipo caspasas y una actividad alta de tipo tripsina en comparación con el proteosoma 26S, por lo que podría producir diferentes tipos de péptidos, debido a su tendencia a producir escisión detrás de aminoácidos hidrofóbicos o básicos. Además, optimiza la respuesta efectora frente a determinados antígenos mediante la activación selectiva de clones de linfocitos CD8+.

Su estudio nos permite comprender mejor los mecanismos de aparición de determinados tipos de cánceres y enfermedades autoinmunes.

• Proteosomas intermedios

Es un proteosoma intermedio entre el proteosoma clásico y el inmunoproteosoma. Se ha observado en tumores del hígado, colon, intestino delgado y células dendríticas. El hallazgo de estos proteosomas intermedios en células dendríticas podría servir como herramienta para la inmunoterapia.

• Timoproteosoma

Son los proteosomas que se encuentran en el timo. Son necesarios para que pueda llevarse a cabo de manera correcta el mecanismo de selección positiva de los linfocitos CD8+, aunque no se sabe muy bien cómo lo hace. Genera de forma constitutiva ligandos de péptidos alterados durante el mecanismo de selección positiva, lo cual jugará un rol importante en el proceso de la tolerancia inmune.

Importancia del sistema: ciclo celular, enfermedades neurodegenerativas y cáncer. 

Esta función que presentan los proteosomas los hace especialmente importantes a la hora de controlar el ciclo celular. Las kinasas dependientes de ciclinas (CDK) controlan la progresión del ciclo celular tras ser activadas por ciclinas. Cuando ya han llevado a cabo su función es necesario que sean eliminadas. Un mal funcionamiento de estas CDK puede producir un proceso tumoral.

La ciclina será poliubiquitinizada y, posteriormente, degradada por el proteosoma, para que pueda continuar el ciclo celular. En concreto, para que la célula finalice la mitosis, requiere que el componente regulador ciclina B se disocie. En las células de vertebrados esta disociación será dependiente de los proteosomas. 

En el cáncer, la mutación de ciertos genes provoca que las células sean inmortales. En estas células (sea por mutación o activación) habrá una sobreexpresión del proteosoma, el cual estará degradando la ciclina en exceso. Esto lo que provoca es que la célula nunca pare de dividirse. 

Teniendo esto en cuenta, muchos fármacos y quimioterapias tienen como diana la alteración o inhibición de los proteosomas, haciendo que las células entren en apoptosis y el cáncer se frenaría. 

Hay muchos tipos de ciclinas que se unen a CDK específicos, por ello, los CDK-inhibidores (p21 y p27) efectúan su acción cuando hay algún daño celular o cromosómico. Estos CDK-inhibidores inhiben el ciclo celular en estos casos siempre y cuando el proteosoma esté inhibido o regulado, ya que en células tumorales se encontraría sobreexpresado y degradando CDK-inhibidores, impidiendo la regulación de este punto de control. 

Otro punto de control del ciclo celular que da lugar a procesos cancerígenos es llevado a cabo por factores de supervivencia celular (ikB y NFKB). A este nivel, la inhibición del proteosoma también provocaría la apoptosis celular al no haber señales de supervivencia. 

El inmunoproteosoma participa en la regulación del desarrollo de tumores. Se ha observado en pacientes humanos con leimoisarcoma uterino, que carecen de una de las subunidades del inmunoproteosoma. También se ha demostrado su sobreexpresión en leucemias agudas. Por lo que se sugiere que, dependiendo del tipo de cáncer, el inmunoproteosoma puede ser una consecuencia de la enfermedad o puede actuar como un factor de desarrollo. Por ello, se ha convertido en un objetivo importante para luchar contra el cáncer, ya que las células cancerígenas son más subceptibles a los inhibidores de proteosomas. Por ejemplo, en el Mieloma Múltiple, que es un trastorno del plasma sanguíneo debido a la proliferación de células tumorales en la médula ósea, se utilizan inhibidores del proteosoma, estimulando así señales apoptóticas.

Las enfermedades neurodegenativas se caracterizan por la acumulación de proteínas aberrantes que tienden a unirse entre sí. El origen de muchas enfermedades neurodegenerativas se debe a un mal funcionamiento del inmunoproteosoma.

En la enfermedad del Parkinson, las neuronas dopaminérgicas dañadas producen un exceso de proteínas anómalas que interaccionan entre sí formando “placas amiloideas”. La célula trata de eliminarlas mediante la vía ubiquitina-proteosoma. Llegada a una edad, estos mecanismos no funcionan bien, provocando la apoptosis neuronal generando la enfermedad. 

La Enfermedad de Alzheimer es un proceso neurodegenerativo de la neocorteza y el hipocampo. En ella se definen dos tipos principales de lesiones: las placas neuríticas y las marañas neurofibrilares. Ambos representan los productos de un trastorno del plegamiento de proteínas que se caracterizan por la proteolisis. Esta acumulación está relacionada con disfunciones de la actividad proteolítica del proteosoma. 

La acumulación de presenilina-2 debido al mal funcionamiento del proteosoma en enfermedad de Alzheimer puede ser asociado con la acumulación de β-amioloide, lo que dificultaría la función del proteosoma con el consecuente daño celular.

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Ana Belén Alonso Aguado, Irene Chavarría Cubel y Rodrigo Díaz Muñoz. 3º Biología Sanitaria, UAH.

Antecedentes históricos: corpúsculo de Barr e hipótesis de Lyon

Figura 11. (A) Dominios SPOC (PDB: 1OW1) y (B) RRM 2-4 de la proteína SPEN (PDB: 4P6Q). Creado con UCSF Chimera y BioRender.

RBM15

RBM15 es una proteína perteneciente a la misma familia que SPEN, por lo que presenta tres dominios conservados RRM (unión a RNA) en el extremo N-terminal y un dominio SPOC (unión a otras proteínas) en el extremo C-terminal. 

Los dominios RRM, al igual que en la proteína SPEN, interactúan con las repeticiones A del Xist RNA. Sin embargo, el dominio SPOC va a interactuar con el complejo proteico METTL3/14 que lleva a cabo la metilación del N6 de adenosinas (m6A). Esta modificación parece estabilizar el RNA, siendo muy abundante en RNAs no codificantes, en este caso Xist RNA, y también en mRNAs.

Asimismo, al igual que en SPEN, el dominio SPOC de RBM15 puede secuestrar otro complejo coactivador de la metiltransferasa H3K4 (SET1B o KMTD2G). De esta forma, disminuye la metilación de la lisina 4 en la histona 3 del cromosoma Xi.

hnRNPK

hnRNPK es otra de las RBPs que interacciona con Xist RNA, en este caso con las repeticiones B/C a través de tres dominios KH (KH1, KH2, KH3) (ver figura 12). Asimismo, a través de su dominio KI cercano al extremo C-terminal, recluta el complejo Polycomb PRC1.

Los complejos multienzimáticos Polycomb catalizan las modificaciones de histonas que conducen a la remodelación de la cromatina.

El complejo PRC1 cataliza la ubiquitinación de la lisina 119 de la histona H2A (H2AK119ub1). Esta modificación promueve la concentración del complejo PRC2 sobre el cromosoma Xi, así como de otros complejos Polycomb. En concreto, el complejo PRC2 produce la trimetilación de la lisina 27 de la histona 3 (H3K27me3).

El mecanismo de acción de los complejos Polycomb aún se desconoce, pero parece que el silenciamiento génico podría ser resultado de:

1. La ubiquitinación y metilación de histonas podría reclutar otras proteínas implicadas en el silenciamiento de los genes.
2. Como resultado de la modificación de las histonas, la cromatina se reorganiza de manera que limita la accesibilidad a los factores de transcripción y la RNA polimerasa II.

Figura 12. Dominio KH de hnRNPK. PDB: 1KHM. Creado con UCSF Chimera.

LBR

LBR es un receptor de la lámina nuclear que interactúa directamente con Xist RNA, por lo que se incluye dentro de las RBPs. Esta unión se produce principalmente entre el dominio SR (tramo de arginina-serina) de LBR y los sitios LBS en las repeticiones F de Xist RNA. 

Por lo tanto, la interacción de LBR con Xist RNA permite la unión del cromosoma Xi a la lámina nuclear (por ello, el corpúsculo de Barr se observa en la periferia nuclear). En estudios recientes, se ha observado que esto podría mejorar la tasa de silenciamiento.

Figura 13. Esquema resumen de  las interacciones de las RBPs con las repeticiones de  Xist RNA (A, F, B, C, D, E), así como los factores reclutados por cada una de ellas que ejercen diversos efectos sobre la estructura de la cromatina y la localización del cromosoma Xi en el núcleo celular. [5]

Xist RNA antagonista del complejo SWI/SNF

El complejo SWI/SNF se encarga de la remodelación de la cromatina y, normalmente, actúa cuando se requiere una activación de la transcripción. En estudios recientes, se ha propuesto el posible papel de Xist RNA como antagonista de este complejo. 

Curiosamente, la deleción del gen Xist produce un aumento de la accesibilidad de la cromatina regulado por BRG1, una subunidad ATPasa del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF. 

Por tanto, parece que la la unión de Xist RNA al cromosoma Xi inhibe la actividad de remodelación del nucleosoma de BRG1 y da como resultado la expulsión del complejo SWI/SNF del Xi.

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Noelia Ares Bóveda, Belén Asenjo Lajusticia e Irene Cañadilla González. Biología Sanitaria. Universidad de Alcalá.

Poco sabía Mary-Claire King en 1994 que su descubrimiento revolucionaría la biología molecular del cáncer: el gen BRCA1 que, junto con el gen BRCA2 descubierto un año después, abrió la puerta a la investigación de diferentes tipos de cáncer y su enfoque en clínica. 

Estos dos genes juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la estabilidad del genoma. Ante su pérdida de funcionalidad, falta o mutación, pueden conducir a fenómenos de tumorigénesis, además de otras patologías como la anemia de Fanconi. 

Sin embargo, no toda mutación implica riesgo de aparición de tumores, y aquí subyace la complejidad de su estudio. 

¿Cómo son estos genes y cómo funcionan? ¿En qué tipos de cáncer están implicados? ¿Qué aproximaciones terapéuticas existen a día de hoy?

FUNCIÓN Y ESTRUCTURA

BRCA1/2 (Breast Cancer Genes) son genes supresores de tumores que juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la estabilidad genómica. Cuando se producen roturas en la doble hebra de DNA (DSB), ocasionando así una interrupción en la lectura del mismo, entran en juego estos genes: las proteínas que codifican llevan a cabo el proceso de recombinación homóloga (HR), uno de los mecanismos de reparación fundamentales que tienen lugar en la fase S del ciclo celular.

La inactividad de estos genes desencadenaría una recombinación homóloga defectiva que en último término podría desembocar en una predisposición al tumor, especialmente en la mama. 

Figura 1: se ilustra el papel supresor de tumores de BRCA1/2 cuando se encuentra activo, mientras que ante su pérdida de funcionalidad se genera una predisposición a la formación de tumores. Created with BioRender.com.

A pesar de tener una función similar, BRCA1 y BRCA2 presentan diferencias en cuanto a su biología molecular, sus interacciones con proteínas y su relación con el cáncer.

BRCA1

El gen BRCA1 se sitúa en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21), y fue descubierto e identificado en 1994. Este gen codifica la proteína BRCA1 supresora de tumores (1863 aminoácidos).

En la proteína BRCA1 encontramos tres clusters asociados al cáncer de mama (BCCR: “Breast Cancer Cluster” Region) y un único cluster asociado al cáncer de ovario (OCCR: “Ovarian Cancer Cluster” Region). Mutaciones en estas regiones aumentan la posibilidad del desarrollo de un cáncer en dichos tejidos específicos.

Figura 2: estructura de la proteína BRCA1 (dominios, clusters) y las proteínas con las que interacciona señaladas con un recuadro. Extraída de la referencia [1].

Esta proteína presenta en su extremo N-terminal un dominio RING rico en cisteína con el que interacciona con la proteína BARD1. Así forma un complejo BRCA1-BARD1 que tiene actividad ubiquitina ligasa. En caso de que haya una mutación en el dominio RING de la proteína BRCA1, esta no podrá unirse a BARD1 y por tanto, se perderá la función ubiquitina ligasa, pudiendo suponer una predisposición al desarrollo de cáncer. 

En su extremo C-terminal presenta el dominio BRCT, que interacciona con la RNA polimerasa II relacionada con el proceso de transcripción. Además, este dominio interactúa con tres proteínas: Abraxas, BACH1, CtIP; estas uniones permitirán la formación de tres complejos distintos implicados en la reparación de DSBs:

• La proteína BRCA1 se asocia a las Abraxas a través de RAP80, y cuando hay un daño en el DNA este complejo interacciona con las histonas dañadas.
• El complejo BRCA1-BACH1 participa en la recombinación homóloga. La proteína BACH1 también es conocida como BRIP1 y tiene función helicasa. 
• La proteína CtIP unida a BRCA1 forma un complejo encargado de la resección de DSBs en pasos tempranos de la reparación.

Figura 3: esquema en el que se ilustran las interacciones de diferentes proteínas con BRCA1 y las funciones de los complejos mencionados. Created with BioRender.com.

BRCA2

El gen BRCA2 se encuentra en el cromosoma 13 (13q12), y fue descubierto e identificado en 1995. Este gen codifica la proteína BRCA2 supresora de tumores, menos conocida pero de mayor tamaño que la codificada por BRCA1 (3418 aminoácidos).

La proteína ácida pequeña DSS1 se une a una región de la proteína BRCA2, formando un complejo proteico que se asociará a las zonas dañadas de DNA.  

La proteína BRCA2 presenta unas repeticiones BRC que permitirán la unión directa a RAD51, una enzima de recombinación necesaria en el proceso. El complejo formado por las dos proteínas juega un papel importante en el reconocimiento de DSBs y el inicio de la recombinación. 

Los clusters ya mencionados localizados en la proteína BRCA1 también se encuentran en la proteína BRCA2.

Figura 4: esquema de la proteína BRCA2, se pueden observar los cluster (BCCR y OCCR). Extraído de referencia [2].

Además, se ha demostrado que el gen BRCA2 tiene un papel fundamental en la citocinesis, ya que mutaciones en este gen conllevan anomalías cromosómicas.

Figura 5: ilustra la unión de las proteínas RAD51 y DSS1 a la proteína BRCA2, así como las interacciones de sus estructuras moleculares (PDB: 1N0W y PDB: 1IYJ). Created with BioRender.com and Chimera.

CONEXIÓN ENTRE BRCA1 Y BRCA2: PALB2

Pero, ¿de qué manera se conectan las proteínas codificadas por BRCA1 y BRCA2? Esto es posible gracias a la proteína PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2). La interacción entre las tres proteínas ocurre de la siguiente forma, tal y como se ilustra en el esquema:

• El extremo N-terminal coiled-coil de PALB2 interacciona con el dominio coiled-coil de BRCA1.
• El extremo N-terminal de BRCA2 se conecta con el extremo C-terminal de PALB2.

Esto daría lugar a la formación del complejo BRCA1-PALB2-BRCA2 el cual es esencial para la recombinación homóloga, así como la activación y mantenimiento del punto de control G2/M del ciclo celular.

PALB2 es susceptible a sufrir mutaciones que podrían conducir a la pérdida de estabilidad genómica y, en consecuencia, un posible desarrollo de cáncer.

Figura 6: se ilustran las regiones de la proteína PALB2 (Partner And Localizer of BRCA2) con las que interaccionan las proteínas BRCA1 y BRCA2, formando el complejo BRCA1-PALB2-BRCA2. Además, se puede observar la interacción ya mencionada de BRCA1 con la proteína BRIP1 (también conocida como BACH1). Esquema extraído de referencia [5].

RELACIÓN CON p53

Se cree que la proteína producto del gen BRCA1 lleva a cabo su función mediante la formación de grandes complejos. En estos complejos participan diversas proteínas, entre las cuales se encuentra la p53, que juega un papel crucial en el mantenimiento de la integridad genómica por su función supresora de tumores.

En muchos de los tipos de cáncer debidos a mutaciones de los genes BRCA, se ha visto que ha habido interrupciones en la relación entre algunos componentes de estos complejos, provocando que la función de los genes BRCA se vea alterada y por tanto se inhiba la supresión del tumor, dando como resultado la aparición de cáncer.

Figura 7: alteraciones en el complejo proteico en el que intervienen BRCA1/2 y p53 pueden conducir a la formación de un tumor, al inhibirse su supresión. Created with BioRender.com. 

Por ejemplo, el complejo BRCA1-BARD1 está implicado en la activación de ciertos puntos de control del ciclo celular. Estas tareas complementarias de BRCA1 en los puntos de control y su rol estabilizador de p53 podrían ayudar en su función de mantenimiento de la estabilidad genómica.  

Muchos estudios sugieren que en la formación del tumor existe una estrecha relación entre la pérdida de función de BRCA1/2 y la pérdida de función de la p53. 

Se cree que la rotura de la molécula de DNA (debida a esa falta de funcionalidad de BRCA) hace que se activen puntos de control dependientes de p53 y/o apoptosis para evitar la tumorigénesis.

MUTACIONES Y CÁNCER

Cuando consultamos la página web del BRCA Exchange, una iniciativa internacional de la Global Alliance for Genomics and Health, encontramos a mes de febrero de 2021 un total de 40389 variantes de estos genes, clasificadas según su significado en clínica en cuanto a su patogenicidad (una escala de patogénico a benigno o sin significado clínico).

Esta cifra nos ilustra uno de los desafíos y la complejidad que supone el estudio de BRCA1 y BRCA2: no todas las mutaciones implican cáncer. 

Las mutaciones en BRCA1/2 implicadas en tumorigénesis generalmente afectan a la mama y al ovario. Pero, ¿a qué se debe el tropismo por estos tejidos?

Ambos tienen gran susceptibilidad a sufrir estimulación hormonal por señales fuertes de crecimiento. La enzima aromatasa está implicada en la síntesis de estrógenos y está regulada negativamente por el gen BRCA1. Además, se ha observado un incremento de los niveles de estrógenos en sangre en personas portadoras de mutaciones en BRCA1, así como de progesterona. Por ello, actualmente se encuentra en estudio la correlación entre niveles hormonales y la predisposición a tumores cuando BRCA1 se encuentra mutado. 

Además, en menor medida estas mutaciones están relacionadas con el cáncer de páncreas, entre otros. 

CÁNCER DE MAMA

Tal y como nos sugiere su nombre, estos genes están asociados con el desarrollo de cáncer de mama, de manera que el riesgo de padecer este tipo de cáncer a lo largo de la vida cuando se produce una pérdida de funcionalidad de BRCA2 es del 45%, mientras que cuando se trata del gen BRCA1 alcanza el 57%.

Un aspecto a remarcar en el desarrollo del cáncer de mama es la importancia de la predisposición genética: cuando se estudian casos de esta enfermedad debidos a la herencia de una mutación, entre todos los genes de susceptibilidad al cáncer de mama descritos, la mayoría de estas mutaciones se han encontrado en BRCA1 y BRCA2.

A modo de curiosidad, en un estudio se ha observado que la expresión tanto de BRCA1 como de BRCA2 es menor en trabajadores a turnos (incluyen jornadas laborales nocturnas) que en trabajadores en turno de día y, además, cuanto mayor es el número de noches trabajadas por mes, menor es la expresión de los genes. Estos resultados llevaron a algunos autores a proponer que esta podría ser la causa de que la alteración del ritmo circadiano pueda conducir a un incremento del riesgo de desarrollo de cáncer de mama (tal y como han comprobado diferentes estudios), y a plantear que los genes BRCA podrían incluirse dentro de los conocidos como “clock-controlled genes”. 

CÁNCER DE OVARIO

El ovario, junto a la mama, es uno de los órganos más afectados por las mutaciones en los genes BRCA. Se piensa que esto puede deberse al estrés oxidativo derivado de los ciclos menstruales, así como al papel de la regulación hormonal (especialmente por estrógenos).

Por ello, la alta predisposición en estos tejidos a sufrir daños en su DNA implica la importancia de los mecanismos de reparación en los que intervienen los genes BRCA. Las mutaciones en el gen BRCA1 suponen un aumento del 11% en el riesgo de sufrir cáncer de ovario y un 40% en el caso de pérdida de funcionalidad del gen BRCA2. 

Figura 8: created with BioRender.com.

CÁNCER DE PÁNCREAS

Se trata del tercer tipo de cáncer más común asociado a la mutación de BRCA. 

Se caracteriza por tener una alta letalidad, debido potencialmente a que presenta una gran resistencia hacia los tratamientos. 

Sólo un pequeño porcentaje de pacientes con cáncer de páncreas presenta mutaciones germinales en BRCA1/2 (aproximadamente el 7%). Por tanto, el cáncer de páncreas causado por mutaciones en BRCA1/2 es poco común; y cabe destacar que presenta una “ventaja” ya que al poseer características biológicas únicas (diferentes a las del cáncer de páncreas común) se pueden crear tratamientos específicos.

Las mutaciones en BRCA1 o en BRCA2 aumentan de manera diferente el riesgo de padecer cáncer de páncreas: si es BRCA2 el afectado, el riesgo de padecer la enfermedad aumenta mucho más que si se trata de mutaciones de BRCA1.

TERAPIAS INNOVADORAS

INHIBIDORES DE PARP (PARPi)

Los inhibidores de PARP (PARPi) se han usado en tratamientos de cáncer  en pacientes sensibles a quimioterapia con platino.

PARP (Poli-ADP-ribosa polimerasa) es una enzima con papel fundamental en el reclutamiento del complejo proteico encargado de restaurar los daños del DNA. Las proteínas BRCA, entre otras, forman parte de estos complejos.

Como ya se ha tratado, una mutación en los genes BRCA resultaría en la transcripción de las proteínas BRCA1 y BRCA2 con una pérdida de funcionalidad y por consecuente, una errónea reparación. 

Figura 9: participación de PARP en la formación del complejo proteico. Created with BioRender.com.

Este tratamiento basado en el uso de inhibidores de PARP consiste en la “captura” (PARP-trapping) de esta enzima. Esto ocasiona la inhibición de los mecanismos de reparación, ya que en caso de que se produjese una mutación en BRCA1/2, la reparación errónea podría conducir a la formación de tumores. De esta forma, al no actuar los mecanismos de reparación, se activa la apoptosis celular y esas células morirían.

Figura 10: esquema ilustrativo de la función de PARPi. Created with BioRender.com.

TERAPIAS BASADAS EN G-CUADRUPLEXOS

Un enfoque terapéutico de gran interés actualmente para tumores en los que el gen BRCA2 se ve implicado se centra en los G-cuadruplexos, unas estructuras formadas por tres láminas de tétradas de guanina unidas por apareamientos de Hogsteen y estabilizadas por un catión metálico. Podemos encontrar estas estructuras al final de las secuencias teloméricas, interfiriendo con su replicación, y se ha observado que BRCA2, entre otras proteínas, interviene en la replicación de los telómeros (de forma que estos no se acortan). 

En trabajos experimentales se ha demostrado que tratamientos de células con pérdida de funcionalidad de BRCA2 con compuestos estabilizadores de G-cuadruplexos disminuye la viabilidad de las mismas, conduciendo de alguna manera a un aumento de la letalidad específica al incrementar la fragilidad de los telómeros. Concretamente, se utilizó la piridostatina (PDS). Otro aspecto que genera interés de este trabajo es que también afecta a aquellas células con pérdida de funcionalidad de BRCA2 que muestran resistencia a los tratamientos con inhibidores de PARP ya mencionados.

Figura 11: en este gráfico se representa un descenso de la viabilidad de las células deficientes en BRCA2 (línea roja) cuando son tratadas con piridostatina (PDS), un estabilizador de G-cuadruplexos. Extraído de los resultados de la referencia [13].

Además, otro compuesto estabilizador de G-cuadruplexos conocido como CX-5461 entró en 2016 en fase I de ensayo clínico para el tratamiento de tumores relacionados con el gen BRCA. 

Con BRCA1 y BRCA2 surgió una nueva manera de concebir el estudio del genoma y el cáncer: pocas décadas atrás existía cierto rechazo en el campo de la ciencia a vincular la aparición de tumores a cambios en el material genético; pero esto cambió con este descubrimiento que tuvo gran impacto en la investigación contra el cáncer.

REFERENCIAS

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[3] Semmler, L., Reiter-Brennan, C. and Klein, A. (2019) ‘BRCA1 and breast cancer: A review of the underlying mechanisms resulting in the tissue-specific tumorigenesis in mutation carriers’, Journal of Breast Cancer, 22(1), pp. 1–14. doi: 10.4048/jbc.2019.22.e6.

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[11] Simhadri, S., Vincelli, G., Huo, Y., Misenko, S., Foo, T. K., Ahlskog, J., Sorensen, C., Oakley, G., Ganesan, S., Bunting, S., Xia, B. (2018) ‘PALB2 connects BRCA1 and BRCA2 in the G2/M checkpoint response’. Oncogene. doi:10.1038/s41388-018-0535-2. 

[12] Xu, H., Di Antonio, M., McKinney, S., Mathew, V., Ho, B., O’Neil, N. J., Santos, N. Dos, Silvester, J., Wei, V., Garcia, J., Kabeer, F., Lai, D., Soriano, P., Banáth, J., Chiu, D. S., Yap, D., Le, D. D., Ye, F. B., Zhang, A., Thu, K., Soong, J., Lin, S. C., Tsai, A. H. C., Osako, T., Algara, T., Saunders, D. N., Wong, J., Xian, J., Bally, M. B., Brenton, J. D., Brown, G. W., Shah, S. P., Cescon, D., Mak, T. W., Caldas, C., Stirling, P. C., Hieter, P., Balasubramanian, S. and Aparicio, S. (2017) ‘CX-5461 is a DNA G-quadruplex stabilizer with selective lethality in BRCA1/2 deficient tumours’, Nature Communications, 8(205). doi: 10.1038/ncomms14432.

[13] Zimmer, J., Tacconi, E. M. C., Folio, C., Badie, S., Porru, M., Klare, K., Tumiati, M., Markkanen, E., Halder, S., Ryan, A., Jackson, S. P., Ramadan, K., Kuznetsov, S. G., Biroccio, A., Sale, J. E. and Tarsounas, M. (2016) ‘Targeting BRCA1 and BRCA2 Deficiencies with G-Quadruplex-Interacting Compounds’, Molecular Cell. The Authors, 61(3), pp. 449–460. doi: 10.1016/j.molcel.2015.12.004.

[14] Rudkin, T. M. and Foulkes, W. D. (2005) ‘BRCA2: Breaks, mistakes and failed separations’, Trends in Molecular Medicine, 11(4), pp. 145–148. doi: 10.1016/j.molmed.2005.02.003.

[15] Mittica, G., Ghisoni, E., Giannone, G., Genta, S., Aglietta, M. and Valabrega,G. (2018) ‘PARP Inhibitors in Ovarian Cancer’, Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 13(4), pp. 392–410. doi: 10.2174/1574892813666180305165256.

[16] Neff, R. T., Senter, L., Salani, R. (2018) ‘BRCA mutation in ovarian cancer: testing, implications and treatment considerations’, Therapeutic Advances in Vaccines, 9(6), pp. 259–261. doi: 10.1177/https.

[17] Venkitaraman, A. R. (2002) ‘Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2’, Cell, 108(2), pp. 171–182. doi: 10.1016/S0092-8674(02)00615-3.

Por Marta García Arauzo y Miriam González Ferrero, Biología sanitaria UAH

Acaba de comenzar febrero, el mes de concienciación de las enfermedades raras. Aunque las enfermedades raras son aquellas con baja prevalencia; se estima que alrededor de un 7% de la población mundial se ve afectada por alguna, lo que resulta ser un gran número de personas. De hecho, cada 30 minutos nace un niño que para los 10 años habrá desarrollado una enfermedad mitocondrial. Las enfermedades mitocondriales son un grupo de trastornos asociados a fallos en el sistema de fosforilación oxidativa. Parte de los componentes de este sistema se codifican en el DNA mitocondrial, y mutaciones en él producirán patologías con síntomas bien definidos. 

Si quieres profundizar sobre las causas y conocer las enfermedades mitocondriales más importantes, ¡sigue leyendo! 

Las mitocondrias son orgánulos citoplasmáticos con la función principal de generar energía en forma de ATP, mediante el proceso de fosforilación oxidativa en condiciones aerobias. Esto se realiza gracias a los complejos enzimáticos I-V de la cadena de transporte de electrones y a dos portadores de electrones (coenzima Q y citocromo c).

Otra función de las mitocondrias es contribuir a la apoptosis o muerte celular programada. Además, presentan funciones específicas de tipo celular como son el metabolismo del colesterol, la oxidación β de los ácidos grasos, la biosíntesis de esteroides sexuales y del hemo, y la termogénesis, entre otras.

Estos orgánulos presentan su propio sistema genético con toda la maquinaria necesaria para su expresión, es decir, replica, transcribe y traduce la información genética que contiene. Por ello se piensa que las mitocondrias tienen un origen endosimbiótico, donde una bacteria fue fagocitada por una célula eucariota ancestral.

El ácido desoxirribonucleico mitocondrial (mtDNA) es una molécula bicatenaria, circular, con un peso molecular de 11 000 000 daltons aproximadamente, sin intrones, se replica a partir de un solo origen y es muy pequeño. El genoma mitocondrial del ser humano se encuentra completamente secuenciado, está compuesto por 16 569 pares de bases que corresponden a un pequeño número de genes. Éstos se encuentran distribuidos entre la cadena pesada H (5 168 726 daltons) y la cadena ligera L (5 060 609 daltons).

La iniciación de la transcripción puede darse en ambas cadenas y se producirá un RNA precursor policistrónico, que será procesado para originar 13 mRNA individuales y 24 productos individuales de tRNA y rRNA.

El 93% de este ácido desoxirribonucleico comprende región codificante; el resto sería de DNA no codificante, que se piensa que actúa controlando la iniciación de la replicación y de la transcripción.

El DNA mitocondrial tiene información para 37 genes que codifican: 13 proteínas que forman parte de subunidades de 4 de los 5 complejos multienzimáticos del sistema de fosforilación oxidativa (sistema Oxphos), 22 ácidos ribonucleicos de transferencia (tRNAs) capaces de leer todo el código genético y 2 ácidos ribonucleicos ribosomales (rRNAs) componentes de los ribosomas específicos mitocondriales. Estos tRNAs y rRNAs se encargan de traducir las 13 proteínas codificadas por el mtDNA.

El resto de polipéptidos que componen estos complejos, así como el complejo II completo, están codificados en el DNA nuclear. Por tanto, la biogénesis del sistema Oxphos requiere una regulación y expresión coordinada entre los genes del mtDNA y el DNA del núcleo celular.

Las subunidades que están codificadas en el DNA nuclear se sintetizan en el citosol, y deben ser transportadas a la mitocondria. Para ello, es imprescindible la proteína de choque térmico chaperonina, que despliega estas subunidades proteicas para que puedan atravesar la doble membrana mitocondrial en forma de largas cadenas. En la matriz mitocondrial, estas subunidades se vuelven a plegar para poder ensamblarse con los demás componentes que forman la cadena de transporte electrónico.

La genética del ácido desoxirribonucleico mitocondrial es muy peculiar, y presenta 5 aspectos fundamentales: poliplasmia, segregación mitótica, efecto umbral, herencia materna y una alta velocidad de mutación.

POLIPLASMIA

Cada mitocondria contiene entre 2 y 10 moléculas de mtDNA, y cada célula contiene múltiples mitocondrias. Por lo que hay un alto número de copias de mtDNA en cada célula (1 000 – 10 000), dependiendo del tejido. Al conjunto de mitocondrias de una célula se le denomina condrioma.

Normalmente, todas las mitocondrias poseen el mismo genoma, lo que se conoce como homoplasmia. Sin embargo, puede producirse una mutación en el mtDNA que afecte solo a algunas mitocondrias, así en una misma célula se encuentran mitocondrias con mtDNA mutado y mitocondrias con mtDNA normal; a esto se le denomina heteroplasmia.

También pueden existir células que en todas sus mitocondrias contengan mtDNA mutado, y la célula se encuentra en homoplasmia pero con mtDNA alterado.

SEGREGACIÓN MITÓTICA

El fenotipo de una línea celular puede variar durante la división celular, ya que las mitocondrias se distribuyen al azar entre las células hijas. Por tanto, si en una célula coexisten mtDNA normal y mtDNA mutado (heteroplasmia), tras varias divisiones celulares, se distribuyen distintas proporciones de genoma mitocondrial mutado y nativo en las células hijas. Así, se originarán tres genotipos diferentes: homoplasmia de mtDNA normal, heteroplasmia y homoplasmia de mtDNA mutado.

EFECTO UMBRAL

El fenotipo de una célula heteroplásmica depende del porcentaje de mtDNA mutado que presente. Si el número de moléculas de mtDNA alterado es relativamente bajo, se producirá una complementación con las moléculas de mtDNA normal y no habrá manifestación del defecto genético.

Cuando el mtDNA mutado sobrepasa un umbral determinado, sí se manifestará un fenotipo patógeno. De este modo, la producción de ATP está por debajo de los mínimos necesarios para el funcionamiento normal de los tejidos, ya que las proteínas codificadas en el mtDNA serán defectuosas, y esto origina una enfermedad en la persona.

El número de moléculas de mtDNA, es decir, el umbral, será distinto en cada órgano y tejido. Esto dependerá de la cantidad de energía requerida para su funcionamiento. Por ello, los tejidos que con mayor frecuencia se ven afectados son la visión, el sistema nervioso central, el corazón, el músculo esquelético, los islotes pancreáticos, el riñón y el hígado.

HERENCIA MATERNA

El mtDNA se hereda con un patrón vertical, no mendeliano, exclusivamente por vía materna. La madre transmite su genoma mitocondrial a todos sus hijos, pero solamente las hijas lo transmitirán a todos los miembros en la siguiente generación, y así sucesivamente.

Esto es debido al gran número de moléculas de mtDNA que contienen los óvulos (entre 100 000 y 200 000 copias), en comparación con unos pocos cientos que contienen los espermatozoides. Además, las mitocondrias que pueden entrar en el óvulo fecundado se eliminan por un proceso complejo en el que participa el sistema proteasoma ubiquitina.

En conclusión, las enfermedades vinculadas a mutaciones en el mtDNA son heredadas de manera exclusiva por línea materna.

ALTA VELOCIDAD DE MUTACIÓN

A diferencia de la recombinación de pares homólogos que tiene lugar en el núcleo, las moléculas de mtDNA no sufren recombinación, por lo que las mutaciones representan la única posibilidad de diversificación genética del mtDNA.

La tasa de mutación espontánea del mtDNA es de unas 10 a 20 veces mayor que en el DNA nuclear. Esto puede deberse a que en la mitocondria se producen continuamente especies reactivas de oxígeno (ROS), como consecuencia de la oxidación final de los compuestos carbonados. Por lo que el mtDNA es particularmente susceptible al daño oxidativo debido a este íntimo contacto con los radicales libres. Éstos dañarán este DNA que no está protegido por histonas y, además, presenta muy pocos mecanismos de reparación.

Algunas de las variaciones de la secuencia serán polimorfismos silentes que no tienen el potencial de un efecto patógeno, mientras que otras variaciones podrán ser mutaciones patógenas.

Las mitocondrias disfuncionales pueden ser eliminadas por digestión lisosomal o, también, las células que posean mitocondrias disfuncionales pueden sufrir apoptosis.

En relación al envejecimiento, la acumulación de las mutaciones en el mtDNA en células somáticas puede contribuir a enfermedades relacionadas con la edad, como el síndrome metabólico y diabetes, cáncer, trastornos cardiovasculares y degenerativos del sistema nervioso central (Alzheimer y Parkinson). Esto es debido a que estas mutaciones contribuyen a la declinación de la fosforilación oxidativa, y así disminución de la capacidad respiratoria de los tejidos. Por tanto, las mitocondrias se deterioran a lo largo de la vida, como consecuencia de la acumulación de mutaciones.

A su vez, la acumulación de mutaciones en el mtDNA producirá un sistema Oxphos ineficaz, con la posibilidad de generación excesiva de ROS, lo que hace que se cree un “círculo vicioso” de daño acumulativo en el genoma mitocondrial.

No obstante, dichas mutaciones somáticas del mtDNA no son transmitidas a la descendencia, por lo que el efecto hereditario de la mutagénesis del mtDNA requiere considerar aparte los acontecimientos en la línea germinal femenina.

Otras utilidades del genoma mitocondrial

Las variaciones en la secuencia de mtDNA entre diferentes individuos han resultado muy útiles para obtener un mayor conocimiento en otras áreas no relacionadas directamente con la clínica, como pueden ser estudios antropológicos, etnológicos y forenses.

En medicina forense, la genética mitocondrial se aplica para identificar personas a partir de restos humanos con abundante mtDNA, como cabello, huesos o dientes.

En el ámbito antropológico, el análisis comparativo del mtDNA entre distintos grupos étnicos del mundo permite establecer la manera en la que se desarrollaron las migraciones de grupos humanos a lo largo del planeta. 

ENFERMEDADES DEL DNA MITOCONDRIAL

El término enfermedad mitocondrial agrupa a todas las afecciones relacionadas con alteraciones en el metabolismo oxidativo mitocondrial. El denominador común de estas patologías es la deficiencia en la biosíntesis de ATP, moneda energética de nuestro organismo.

El origen de estas enfermedades reside en mutaciones del mtDNA (mutaciones puntuales, deleciones o duplicaciones), y en alteraciones de la señalización genómica entre el DNA nuclear y el mitocondrial. Si la disfunción mitocondrial ocurre en la cadena respiratoria, estaremos hablando de citopatías mitocondriales.

Pinchando aquí puedes ver las enfermedades producidas por las mutaciones en los distintos genes relacionados con la cadena mitocondrial. Facilitado por la AEPMI (asociación de enfermos de patología mitocondrial).

Los déficits enzimáticos de la cadena respiratoria pueden ser únicos (cuando afectan a un solo complejo de la cadena respiratoria), o múltiples (afectan a varios). Las mutaciones del mtDNA suelen ser causadas por déficits múltiples, afectando a varios tejidos y causando la heterogeneidad de cuadros clínicos. De hecho; el mal funcionamiento de tres o más sistemas es característica principal del diagnóstico de las enfermedades mitocondriales.

Desde que en la década de 1960 se observaron por primera vez acúmulos musculares de mitocondrias en individuos con intolerancia al ejercicio, posteriormente se han ido relacionando las disfunciones mitocondriales con numerosas enfermedades: trastornos neurodegenerativos, cardíacos, enfermedades neurometabólicas, cáncer, obesidad, etc. Al limitarse el nivel de ATP, suelen verse más afectados los tejidos con alta necesidad energética, como cerebro, músculo, hígado, corazón, riñones y SNC. Entre las manifestaciones clínicas más frecuentes se encuentran la sordera, ceguera, diabetes, ataxia, debilidad muscular, disfunciones hepáticas y pancreáticas y fallos en el corazón, riñones e hígado.

Esta gran variedad de manifestaciones clínicas supone un reto para el diagnóstico de enfermedad mitocondrial. Cuando en un paciente se presentan uno o más de estos síntomas, la sospecha clínica debe ser ratificada por pruebas metabólicas específicas de disfunción mitocondrial, y finalmente, tras realizar pruebas de confirmación morfológicas, histoenzimáticas, bioquímicas o genéticas, sus resultados nos pueden conducir al diagnóstico de disfunción mitocondrial. En la siguiente imagen puedes consultar el protocolo a seguir desde la sospecha médica.

Existen síndromes clínicos específicos, bien definidos, de los que vamos a introducir los más representativos.

CPEO: Oftalmoplejía externa progresiva crónica

El signo principal de este síndrome es la blefaroptosis, también llamada ptosis palpebral o párpado caído, junto con paresia (debilidad) simétrica de los músculos extraoculares. También suele acompañarse de miopatía proximal de las extremidades, intolerancia al ejercicio y debilidad muscular.

El CPEO está causado por deleciones grandes y normalmente espontáneas del mtDNA. Se ha observado que muchas de las deleciones encontradas están delimitadas por repeticiones directas de 3 a 13 nucleótidos. Esto podría significar que la presencia de estas repeticiones conlleva a errores en la replicación, que serían los responsables de la deleción.

Algunos casos también ocurren por mutaciones puntuales, como la del gen del tRNA Leu^UUR en A3243 (la A proviene de la base adenina y el número representa la posición del nucleótido 3,243). En un ínfimo porcentaje de individuos se ve afectada la región del DNA mitocondrial con genes que codifican para rRNA.

Este síndrome aparece antes de los primeros 20 años de vida.

Síndrome de Kearns-Sayre

Es una enfermedad variante de la CPEO más grave y peculiar que también aparece antes de los 20 años de edad. Además de oftalmoplejía progresiva crónica y retinitis pigmentaria atípica se suma uno de los siguientes problemas: bloqueo cardíaco, síndrome cerebeloso (alteración funcional del cerebelo) e hiperproteinorraquia, que consiste en una cantidad de proteína superior a 100 mg/L en LCR. Al conjunto de estos tres problemas multisistémicos se denomina la tríada clásica.

La siguiente imagen es útil para explicar la retinopatía pigmentaria:

MERRF o síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojo-rasgadas

Las manifestaciones clínicas de este síndrome son epilepsia mioclónica o mioclonías, convulsiones generalizadas y miopatía con presencia de fibras rojo-rasgadas.

Con estos síntomas, realizar un electroencefalograma es muy interesante para el diagnóstico, pues registra las mioclonías y puede determinar su origen.

Las mioclonías son movimientos musculares involuntarios originados por una actividad anormal de la corteza sensomotora. Las fibras rojas forman unidades motoras tónicas, de contracción lenta. Son resistentes a la fatiga y de ellas dependerá el correcto mantenimiento del equilibrio y la postura y los movimientos de poca intensidad. Por eso, la disfuncionalidad de las fibras rojas conlleva errores en este tipo de ejercicios.

En algunos pacientes aparecen síntomas clínicos adicionales como demencia, sordera neurosensorial, neuropatía sensitiva, atrofia óptica, fallo respiratorio y cardiomiopatía.

Es un síndrome de curso progresivo que aparece tanto en la infancia como en edad adulta. Como es de herencia materna, podemos estudiarlo mediante pedigríes.

MERRF se asocia principalmente a mutaciones puntuales del gen del tRNA Lys en la posición A8344G (transición de adenina por guanina en la posición 8,344) o, de forma minoritaria, en T8356C. La mutación A8344G altera específicamente el bucle TᴪC del tRNA Lys, lo cual reduce la síntesis proteica celular. Todas las mutaciones son en forma heteroplásmica. Los jóvenes con un 95% de heteroplasmia pueden desarrollar este síndrome, mientras que los adultos de entre 60-70 años o más podrán hacerlo con solo un 60% del DNA mutado. La razón de que haya personas que nacen con fenotipo normal y desarrollan MERRF en la edad adulta puede ser que, con la edad, la capacidad oxidativa de la mitocondria se reduce, promoviendo la aparición de la enfermedad.   

MELAS: Síndrome de encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios de accidentes cerebro-vasculares

Con solo leer el nombre, ya nos hacemos una idea de los síntomas de la enfremedad. Básicamente, el acrónimo MELAS nos explica que este síndrome consiste en encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica e ictus cerebrales semejantes a apoplejías. Estos ictus son reversibles y pueden ser visualizados a través de resonancia magnética o PET. Los recién nacidos con este síndrome son sanos, sin embargo, durante los primeros años de vida dejan de crecer súbitamente y se empiezan a presentar los síntomas comentados. Estas manifestaciones suelen acompañarse de convulsiones generalizadas, dolor de cabeza, sordera, demencia y, a veces, de fibras rojo-rasgadas.

MELAS, al igual que MERRF, se hereda por vía materna. Esta enfermedad ha sido asociada fundamentalmente con mutaciones en el gen del tRNA Leu^UUR del mtDNA. Alrededor del 80% de los casos son causados por una transición en A3243G, pero se han encontrado otras con menor incidencia, como A3271G, también en el tRNA Leu^UUR y alguna en genes codificantes de proteínas, todas en forma heteroplásmica.

Si lo recuerdas, la transición A3243G también la hemos visto en CPEO (oftalmología progresiva externa crónica), y además también aparecen sordera, miopatía o diabetes; es decir, esta mutación tiene efectos fenotípicos muy variables.

Al ser dañado el tRNA, la síntesis de proteínas mitocondriales se verá comprometida.

LHON: Neuropatía óptica de Leber

Se caracteriza por la pérdida de la visión bilateral, indolora, aguda o subaguda, debido a la atrofia del nervio óptico. Aparece en la segunda o tercera década de la vida de hombres y mujeres, más frecuentemente en los primeros. A parte de la afectación de la visión, también puede aparecer neuropatía retrobulbar y periférica, síndrome piramidal y cerebeloso, el fondo de ojo con edema, tortuosidad de los vasos retinianos e incluso trastornos en la conducción cardiaca.

El síndrome de Lohn fue la primera enfermedad humana de herencia materna que fue asociada con una mutación puntual del mtDNA. Estas mutaciones se pueden encontrar de forma homo y heteroplásmica y se han descrito en gran número. Esto es relevante pues las manifestaciones clínicas dependen de la mutación existente. Las tres mutaciones primarias o patogénicas verdaderas están en genes que codifican para proteínas constituyentes del complejo I de la cadena respiratoria. Son G3460A, T14484C y G11778A, esta última asociada al 50% de los casos y responsable de la forma más severa de la enfermedad. 

MILS: Síndrome de Leigh de herencia materna

Consiste en encefalomielopatía necrosante subaguda; es decir, lesiones necróticas cerebrales en tálamo, ganglios basales, tronco cerebral y médula espinal. La esperanza de vida es muy limitada y suele aparecer durante el primer año de vida.

Se puede acompañar de alteraciones respiratorias y de la deglución (por estar afectado el tronco cerebral), además de parálisis oculomotoras, atrofia óptica, leucodistrofia, movimientos involuntarios o hiperproteinorraquia (disminuyendo así la conducción nerviosa). Además, las habilidades psicomotoras adquiridas tienden a empeorar.

El síndrome de Leigh está causado por la transversión de T por G en el gen de la subunidad 6 de la ATPasa, T8993G.

Hasta aquí hemos comentado las enfermedades mitocondriales más representativas, pero cabe destacar que, en numerosas ocasiones, no es posible catalogar dentro de los síndromes específicos a todos los pacientes diagnosticados con enfermedad mitocondrial. Esto se debe fundamentalmente a la enorme diversidad en las manifestaciones clínicas que cada paciente desarrolla. Además, el fenotipo clínico de un paciente mito evoluciona a lo largo del tiempo, desarrollando otros síntomas y signos diferentes a los que presentaba cuando se realizó el diagnóstico.

En cuanto al tratamiento, no existen medidas curativas que reviertan la disfunción mitocondrial, sino que se seguirá un tratamiento farmacológico y nutricional destinado a enlentecer el proceso de degeneración natural. También es importante la terapia psicológica y de mantenimiento para lograr la mayor calidad de vida de los pacientes.

Como hemos visto, casi la totalidad de estas enfermedades se manifiestan en las primeras dos décadas de vida. Por esto, es importante que, especialmente los niños, se enfrenten de manera positiva y esperanzadora al diagnóstico recibido. Una herramienta útil para ellos puede ser el siguiente cuento redactado por la Obra Social del Hospital Sant Joan de Déu, que explica la enfermedad de una forma amena y lúdica.

Es muy importante que todos los enfermos de estas patologías se sientan acompañados y comprendidos. Para ello, resulta esencial la concienciación poblacional de estas enfermedades, de cara no solo a conseguir financiación para seguir investigando, sino también para acercar el conocimiento de las mismas a todas las personas, aunque no les afecte directamente. Existen varias asociaciones que ayudan a conseguir esto, como la Asociación de Enfermos de Patologías Mitocondriales (AEPMI).

Además, la página web de una fundación australiana contiene numerosos testimonios de personas afectadas por enfermedades mitocondriales, lo cual es otra forma muy útil de que un mayor número de personas conozcan estas patologías.

También se realizan numerosas campañas como carreras solidarias #RunForMito, recogida de tapones o dispositivos tecnológicos en desuso, venta de productos solidarios, o campañas de iluminación como #LightUpForMito, que se realizó con razón de la Semana mundial de la concienciación de enfermedades mitocondriales, celebrada en septiembre, y a la que se sumaron numerosas asociaciones y ayuntamientos, consiguiendo promover la sensibilización muchas personas y dando voz a todas las familias afectadas. 

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