UN FALLO DURANTE EL PROCESO DE SPLICING DA ORIGEN A LA ATROFIA MUSCULAR ESPINAL

Por Álvaro Martínez Garrido y Adrián Rodríguez Llave. Grado en Biología Sanitaria – Universidad de Alcalá de Henares

La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad neurodegenerativa originada por el deterioro progresivo de la capacidad de transmisión sináptica de las motoneuronas del asta anterior de la médula espinal. La pérdida de función de estas neuronas ocasiona en los pacientes debilidad muscular y atrofia de los músculos de las extremidades y de la caja torácica. En los casos graves puede afectar a la musculatura respiratoria y a la musculatura implicada en la deglución. La enfermedad fue descrita por primera vez a finales del siglo XIX por Guido Werdnig y Johann Hoffmann, que la caracterizaron como una afección muscular infantil que provocaba la muerte prematura de los niños afectados.

Si bien pertenece al grupo de las enfermedades raras, la atrofia muscular espinal es una de las causas genéticas de mortalidad infantil más importantes, ya que aparece en la población con relativa frecuencia (1 de cada 10.000 recién nacidos presentan la enfermedad). Se trata de un trastorno de etiología genética, que sigue un patrón de herencia autosómico recesivo, por lo que es necesario que ambos padres porten una copia del gen defectuoso. La AME se produce como consecuencia de un déficit de la proteína SMN, la cual cumple una labor fundamental en el proceso de splicing de nuestras células.

En este trabajo analizaremos en detalle la estructura de la proteína SMN y la importancia que desempeña dentro del proceso de corte y empalme, además de estudiar las causas genéticas de la atrofia muscular espinal y el origen de las mutaciones causantes de la enfermedad. Por último, nos gustaría ofrecer una visión general acerca de las expectativas actuales que giran en torno a la búsqueda de nuevos tratamientos efectivos.


PROTEÍNA SMN Y SU PAPEL FUNCIONAL

La proteína de supervivencia de motoneuronas (SMN) está formada por 294 aminoácidos (38 kDa) y se expresa ubicuamente en todos los tejidos, localizándose tanto en el citoplasma como en el nucleoplasma de la célula. La estructura que tiene esta molécula permite su interacción con otras proteínas y ácidos nucleicos, por lo que parece tener un papel importante en varias funciones esenciales de la célula, sobre todo en el procesamiento del mRNA, proceso en el que actúa como un componente fundamental de la maquinaria de splicing al participar en el ensamblaje de las ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP) que forman parte del espliceosoma.

Características estructurales de SMN

Figura 1: Estructura del gen SMN; podemos ver los 9 exones que codifican para la proteína en relación con los dominios: secuencia rica en lisinas (K), dominio Tudor, secuencia rica en prolinas (P) y caja YG (tirosina-glicina). Imagen creada con BioRender.com. Adaptado de Barquín Toca, A., 2018.

La proteína SMN posee varios dominios conservados en su secuencia de aminoácidos que son fundamentales para que pueda llevar a cabo su función en la formación de las snRNP y la maduración del pre-mRNA en el núcleo. Existe un segmento corto rico en lisinas (K) cerca del extremo N-terminal (a la altura de los exones 2a y 2b) que es esencial para la unión con alta afinidad a GEMIN2 (G-2), así como para el autoensamblaje de la proteína.

Por otro lado, el exón 3 contiene el llamado dominio Tudor, una zona central muy conservada a lo largo de la evolución que permite la unión a las proteínas Sm. Dicha unión es posible gracias a que este dominio es capaz de reconocer modificaciones simétricas de dimetilarginina (sDMA) que se localizan en regiones ricas en arginina y glicina de las proteínas Sm.

En el exón 5, y abarcando también parte de los exones 4 y 6, se encuentra una secuencia abundante en residuos de prolina, la cual se ha especulado que podría intervenir en la asociación con profilinas, unas proteínas de unión actina que participan en el ensamblaje de los filamentos del citoesqueleto.

Finalmente, en el extremo C-terminal encontramos el dominio denominado caja YG (tirosina-glicina), que es el principal responsable de la oligomerización de la proteína SMN consigo misma formando cremalleras de glicina. La secuencia de la caja YG  se localiza en el exón 6 y contiene tres motivos superpuestos (GxxxGxxxG, YxxxYxxxY y SxxxSxxxSxxxT)1 que son fundamentales para el autoensamblaje, estabilidad y localización celular de la proteína.

1 Siendo G = glicina, Y = tirosina, S = serina y T = treonina.

Figura 2: Estructura tridimensional de la caja YG. Haga click sobre la imagen para ver la animación 3D. Estructura tomada de PDB (4GLI). The Survival Motor Neuron Protein Forms Soluble Glycine Zipper Oligomers por Renee Martin (https://doi.org/10.1093/nar/gkab158)

A la hora de oligomerización, los residuos de glicina interconectados se compactan firmemente entre sí. En segundo lugar, los residuos de tirosina y leucina de cada hélice se empaquetan herméticamente contra los residuos de glicina de la hélice de interfaz. Cada unidad dimérica de la cremallera de glicina está apilada una sobre otra de manera antiparalela alrededor de un eje de tornillo entre los aminoácidos serina (posición 130) y alanina (posición 134), lo que lleva a un apilamiento infinito. 

Figura 3: Eje de oligomerización de las cajas YG. Tomada de Identification and structural analysis of the Schizosaccharomyces pombe SMN complex por Jyotishman Veepaschit (https://doi.org/10.1093/nar/gkab158)

La proteína SMN es capaz de interaccionar consigo misma formando oligómeros una vez se encuentra en el citosol. Al mismo tiempo que ocurre su autoensamblaje, la proteína SMN se asocia con las proteínas Gemin (destaca SIP1 o Gemin 2) y la proteína de interacción UNR (UNRIP), dando lugar al denominado complejo SMN. Este último se corresponde con la estructura que origina la proteína SMN durante la organización de la maquinaria de splicing y es fundamental para que pueda cumplir su función. El complejo SMN se une a su vez con las proteínas Sm y todo el conjunto es transportado al interior del núcleo gracias a la acción de la importina β y la esnurportina 1. 

Dentro del núcleo, el complejo SMN se concentra formando unas estructuras nucleares llamadas gems, las cuales pueden estar libres en el nucleoplasma o asociadas con los cuerpos de Cajal. La función concreta de los gems se desconoce, aunque se ha especulado que podría tratarse de lugares de almacenamiento para el exceso nuclear de complejos SMN. Por otro lado, los cuerpos de Cajal se han propuesto como sitios de ensamblaje y reciclaje de las snRNP espliceosomales. La reducción del número de gems como consecuencia de la disminución de la cantidad de proteína SMN constituye una de las alteraciones celulares más frecuentemente observadas en las preparaciones histológicas procedentes de pacientes.

Maquinaria de splicing

El espliceosoma es un complejo ribonucleoproteico que se encarga de llevar a cabo el reconocimiento y eliminación de intrones para la maduración del transcrito primario eucariota en el núcleo. La maquinaria espliceosomal se compone principalmente de cinco RNAs nucleares pequeños transcritos mediante la polimerasa II (U1, U2, U4 y U5) y la polimerasa III (U6). Cuando estos son exportados al citoplasma, forman ribonucleoproteínas (U-snRNPs) al unirse a 7 proteínas Sm (SmB/B’, SmD1, SmD2, SmD3, SmE, SmF y SmG), dando lugar a una estructura toroidal. 

En el ensamblaje citosólico de estos intervienen el complejo de proteína arginina metiltransferasa 5 (PRMT5) y el complejo de neurona motora de supervivencia (SMN). El complejo PRMT5 está formado por la metiltransferasa PRMT5, la chaperona de ensamblaje pICln y WD45 o MEP50. Su principal misión es la de catalizar la metilación simétrica de residuos de arginina en proteínas Sm y la formación de complejos de proteínas Sm de orden superior, dando lugar a dos intermedios de ensamblaje diferentes: un complejo 6S en forma de anillo compuesto por pICln y SmD1, SmD2, SmE, SmF y SmG, y un heterotrímero pICln-SmB-SmD3. Debido a que la asociación de pICln con proteínas Sm evita la unión a los RNAs nucleares pequeños, para terminar el ensamblaje se requiere de la actividad del complejo SMN (SMN, Gemins 2-8 y UNRIP) que permitirá la liberación de pICln y el reclutamiento de RNAs nucleares pequeños durante el ensamblaje de U-snRNPs.

Llegados a este punto, las ribonucleoproteínas sufren una trimetilación de la caperuza 5’ y son importados de nuevo al núcleo, concluyendo así la fase de maduración citosólica. Finalmente, la biogénesis de U-snRNPs se completa en los cuerpos de Cajal, donde se reclutan proteínas específicas y los RNAs nucleares pequeños son modificados.

Una vez formado el espliceosoma, es dirigido al citosol donde se unirá a una serie de sitios específicos que indican los puntos que precisan de un corte. Los intrones presentan una adenina en un punto específico (“transpoint”) que es reconocida por las riboproteínas. El proceso comienza con la unión de U1 y U2 a sus sitios de reconocimiento (extremo 5’ del intrón y transpoint, respectivamente). Entonces, se unen el resto de ribonucleoproteínas (U4, U5 y U6) y se forma el lazo, que se activa al liberarse los factores U4 y U1. Estas proteínas dan forma al RNA para permitir que se acerque y se produzca el corte del intrón.Las reacciones que tienen lugar durante el splicing son transesterificaciones: al acercar la adenosina específica del intrón (“transpoint”) al extremo del intrón, su OH–2’ ataca el enlace y estos se unen entre sí (primera transesterificación); el extremo que ha quedado libre del exón, ataca al otro extremo (segunda transesterificación) liberando así el intrón y uniendo ambos exones.

Figura 4: Esquema del proceso de splicing. Imagen creada con BioRender.com. Adaptado de Lehninger, A., 2019.

GÉNETICA DE LA SMN

El principal gen que codifica la proteína SMN es el gen telomérico SMN1 (34 kb), del cual se obtiene un transcrito primario de 9 exones (1, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6, 7 y 8) que, tras su maduración, dará lugar a la proteína funcional. Dentro de nuestro genoma, existe una segunda copia centromérica de este gen, el SMN2, que mayoritariamente da lugar a proteínas SMN truncadas que no resultan funcionales y terminan siendo degradadas. El estudio de diversos modelos animales ha permitido verificar que la mayoría de los eucariotas tienen una única copia del gen SMN, por lo que los seres humanos serían una excepción al presentar dos copias de este gen separadas por alrededor de 500 kb en una gran duplicación invertida en el cromosoma 5. Esta región duplicada es de elevada complejidad y presenta una gran cantidad de elementos repetitivos que la hacen propensa a sufrir deleciones y reordenamientos. De hecho, la expresión y/o localización aberrantes de SMN se han asociado con varias otras enfermedades, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), trastornos metabólicos, infertilidad masculina y trastornos asociados al estrés.

Diferentes análisis genéticos realizados sobre la población nos indican que el gen SMN1 está siempre presente, mientras que el gen SMN2 aparece en alrededor del 95% de los individuos. Esta situación nos lleva a la conclusión de que la versión telomérica (SMN1) constituye el gen ancestral. Sin embargo, el gen telomérico SMN1 es el que se encuentra mutado o delecionado en los enfermos de AME, mientras que el gen centromérico SMN2 normalmente no se ve afectado y aparece en un número de copias variable. Ambos genes codifican proteínas SMN de 294 aminoácidos, pero una mutación puntual y silenciosa (C→T) en la posición 6 del exón 7 del gen SMN2 da lugar a un proceso de corte y empalme alternativo del transcrito primario, el cual resulta en la eliminación de dicho exón 7. Como resultado, el 90% del producto de la transcripción del gen SMN2 es una proteína truncada (SMNΔ7) incapaz de originar oligómeros que es degradada rápidamente, mientras que el otro 10% corresponde con proteína de longitud normal, estable y funcional, capaz de polimerizar.

Figura 5: Diferencias entre los productos de traducción de SMN1 y SMN2 como resultado de la mutación puntual en el exón 7 de SMN2. Imagen creada con BioRender.com. Adaptado de Arnold, E. S., & Fischbeck, K. H., 2018.


PRINCIPALES MUTACIONES QUE AFECTAN A SMN1

Las mutaciones en el gen SMN1 fueron identificadas en 1995 como causa de la AME, ya que este gen presenta deleciones o interrupciones en más del 95% de los pacientes. Como consecuencia de estas mutaciones, se produce una deficiencia de proteína SMN que afecta a la función de las snRNP y origina una forma ineficaz de pre-mRNA, interrumpiendo la transcripción de proteínas que son necesarias para las motoneuronas.

Las alteraciones genéticas en pacientes con AME normalmente consisten en sustituciones de aminoácidos en las regiones Tudor y YG-box. De hecho, el dominio YG es el principal punto caliente para las mutaciones sin sentido que causan AME, ya que aproximadamente el 50% de las mutaciones descritas se asignan a esta región. Las alteraciones en la YG-box originan variantes defectuosas de la proteína SMN que son incapaces de llevar a cabo el autoensamblaje y que, por tanto, son degradadas rápidamente. 

Las mutaciones de sentido erróneo en el dominio YG también pueden provocar una unión deficiente de Gemin 8 a SMN. Dado que Gemin 8 cumple un papel fundamental en el mantenimiento de la arquitectura del complejo SMN, este último no puede llevar a cabo su función. Por lo tanto, concluimos que las mutaciones de sentido erróneo en el dominio YG de SMN interfieren con la oligomerización de la proteína, la unión a G8 o ambos.

Figura 6: A) Secuencia de la proteína SMN y localización de las mutaciones más frecuentes (señalizadas con asteríscos según su frecuencia). B) Comparación de la secuencia peptídica de la caja YG de diferentes organismos; los residuos idénticos en cuatro de las seis secuencias aparecen marcados en negrita. Tomada de The Survival Motor Neuron Protein Forms Soluble Glycine Zipper Oligomers por Renee Martin (https://doi.org/10.1093/nar/gkab158)

Es importante no confundir las mutaciones patógenas en el gen SMN1 causantes de la AME con la mutación puntual que afecta al gen SMN2. Ambas mutaciones originan proteínas truncadas incapaces de oligomerizar consigas mismas, pero las deleciones o modificaciones puntuales en el gen SMN1 solo aparecen en pacientes de AME, mientras que el cambio de citosina por timina en la posición 6 del exón 7 del gen SMN2 ocurre en todos los individuos, ya que la versión centromérica del gen siempre resulta defectuosa (si bien su traducción origina un 10% de proteína activa).


PATOGENIA Y POSIBLES TRATAMIENTOS DE LA ATROFIA MUSCULAR ESPINAL

¿Por qué las motoneuronas son las principales afectadas?

Hasta ahora se ha hablado de la proteína SMN como un elemento esencial para el ensamblaje de la maquinaria de splicing. Es por esta razón que, en teoría, su déficit debería afectar a varios tipos celulares y causar diversas alteraciones, sin embargo, la disminución del nivel de SMN parece dañar más a las motoneuronas del asta anterior que al resto de células del organismo. El motivo por el cual estas células son más sensibles a la ausencia de la proteína SMN todavía se desconoce, aunque se ha especulado que las neuronas motoras tienen una tasa de transcripción mayor en comparación con otros tipos celulares y, quizás por ello, tienen una mayor necesidad de proteína SMN, mientras que en otros tejidos la alteración en el gen SMN podría ser neutralizada por otros factores genéticos de origen desconocido. Además, existen evidencias de que la proteína SMN parece estar implicada en funciones relacionadas específicamente con la supervivencia de las neuronas motoras, como el transporte axonal o la formación de gránulos de estrés.

El número de copias de SMN2 determina el fenotipo de la enfermedad

En la AME, la pequeña cantidad de proteína SMN formada a raíz de la expresión de SMN2 evita la letalidad que podría causar la falta de traducción de SMN1. Sin embargo, esta concentración baja de SMN resulta insuficiente para contrarrestar la evolución de la enfermedad. Por lo tanto, la AME es el resultado del déficit, pero no ausencia, de proteína SMN funcional. Esta correlación directa entre la gravedad de la AME y la cantidad de proteína SMN presente explica que, en ausencia del gen SMN1, el número de copias del gen SMN2 es lo que determina la severidad de la enfermedad.

De esta manera, el grado de afectación de las neuronas varía y no resulta igual para todos los pacientes, ya que existen desde casos en el periodo neonatal que presentan una corta esperanza de vida hasta pacientes adultos en los que la enfermedad apenas genera manifestaciones graves. Es por ello que la AME se clasifica generalmente en cuatro grupos en función de la intensidad de la debilidad muscular, el pronóstico de la enfermedad y la edad a la que comienzan a aparecer las manifestaciones clínicas. Los individuos que poseen un menor número de copias del gen SMN2 padecerán los subtipos de la enfermedad con peor pronóstico, mientras que los que presentan más copias del gen SMN2 sufrirán un cuadro clínico menos grave. Es decir, SMN2 actúa como una especie de modulador genético de la enfermedad, decidiendo la evolución del trastorno.

En el caso de la AME de tipo I, la enfermedad suele manifestarse en las primeras semanas tras el nacimiento, generalmente antes de los seis meses. Los bebés afectados presentan una marcada reducción del tono muscular y tienen problemas para realizar movimientos, por lo que no consiguen sentarse, mantener la cabeza erguida o caminar sin ayuda. Se trata de la forma más frecuente y grave de la enfermedad y a menudo suele causar la muerte antes de los 2 años de edad debido a la falta de contracción de los músculos respiratorios y de los músculos implicados en la deglución.

La AME de tipo II constituye una forma más moderada de la enfermedad de aparición más tardía, normalmente antes de los 18-24 meses. Los niños con este subtipo son capaces de sentarse sin apoyo, pero precisan de una silla de ruedas para poder desplazarse y suelen tener problemas para respirar. La enfermedad acorta significativamente la esperanza de vida de estos jóvenes. 

Respecto a la AME de tipo III, los síntomas clínicos suelen comenzar pasados los 18 meses y pueden llegar a retrasarse hasta la adolescencia, aunque en general aparecen antes de los 6 años. Los pacientes con esta última variante de la enfermedad pueden desplazarse de manera independiente, pero pueden tener problemas para llevar a cabo algunas actividades que requieren más esfuerzo (correr, subir escaleras…). La debilidad muscular es progresiva y suele venir acompañada de problemas de escoliosis o deformidad del tórax.

La AME tipo IV a menudo se clasifica como una forma tardía de la AME de tipo III y con frecuencia aparece en la edad adulta, pasados ya los 30 años. La atrofia afecta principalmente a la musculatura proximal y no suele dar lugar a complicaciones mayores, aunque algunos pacientes pueden presentar temblores y complicaciones respiratorias. La esperanza de vida generalmente no se ve afectada.

El análisis molecular de las muestras de DNA procedentes de pacientes ha permitido demostrar que la mayoría de los pacientes de AME tipo II o III poseen tres o más copias del gen SMN2, mientras que los pacientes de AME tipo I presentan una o dos copias. De acuerdo con esto, la cantidad de proteína SMN será mayor en pacientes con formas menos severas de la enfermedad. Esto explica porqué el número de gems hallados en el interior del núcleo de las motoneuronas de los pacientes con AME tipo I es mucho menor en comparación con el número de gems identificados en las muestras de pacientes con AME tipo IV, III o II. 

A pesar de ello, cabe destacar que en ocasiones se han identificado pacientes con AME tipo I y pacientes con AME tipo II o III que presentan exactamente el mismo número de copias del gen SMN2. Se han propuesto diferentes teorías para estas excepciones, pero la más aceptada es la que explica que la expresión del gen SMN2 parece estar regulada por un mecanismo de metilación. Cuando SMN2 se encuentra ligeramente metilado (hipometilado), su expresión se ve estimulada y se produce mayor cantidad de proteína SMN. Sin embargo, una elevada metilación (hipermetilación) del gen SMN2 impide su expresión y, como resultado, la concentración de proteína obtenida es menor. De esta manera, podríamos justificar porqué en ocasiones el número de copias del gen SMN2 no se corresponde con el subtipo de la enfermedad que poseen los pacientes.

Papel del gen NAIP

Recientemente también se ha relacionado el número de copias del gen SMN2 y la deleción del denominado gen NAIP. Este gen codifica para la proteína 1 que contiene repetición IAP baculoviral y forma parte de la duplicación invertida del cromosoma 5 en la que se encuentran los genes SMN1 y SMN2. Se ha especulado el papel de este gen como indicador de la severidad de AME, ya que el análisis combinado de la deleción de este gen y el número de copias de SMN2 muestra que aproximadamente el 50% de los pacientes con AME tipo I presentan deleción del gen NAIP, mientras que tan solo el 7% de los afectados por AME II o III sufren esta deleción. Sin embargo, no se ha evidenciado que el incremento del número de copias del gen NAIP disminuya la gravedad de la enfermedad, simplemente se ha constatado que este gen puede ser usado para predecir la severidad de la AME, ya que se encuentra delecionado en muchos de los pacientes que sufren la forma más complicada de este trastorno.

El gen SMN2 como base para la búsqueda de un tratamiento efectivo

Diversos grupos de investigación han sugerido diferentes estrategias terapéuticas para mejorar la calidad de vida de los pacientes con AME e incluso lograr una cura de la enfermedad. Una de las principales líneas de investigación trata de lograr el reemplazo del gen SMN1 mutado mediante el empleo de vectores virales capaces de transfectar las neuronas motoras de la médula espinal (destaca dentro de este grupo la terapia génica basada en la utilización del serotipo 9 del virus adenoasociado). Grupos como el equipo francés Institut de Myologie (París) lograron resultados efectivos en ratones recién nacidos que padecían la enfermedad, ya que consiguieron que dichos ratones tuviesen una mayor esperanza de vida gracias a la inyección de vectores virales AAV que portaban una secuencia no mutada del gen SMN1. Sin embargo, esta técnica presenta varias limitaciones, principalmente que los virus usados a menudo no son capaces de difundir en el parénquima del tejido diana y que el método todavía no ha logrado resultados satisfactorios en células humanas.

Es por esta razón que desde el descubrimiento de la estrecha relación entre el número de copias de SMN2 y la severidad de la enfermedad, el interés terapéutico se desplazó a intentar potenciar la expresión del gen SMN2 ya que, como bien hemos señalado, esta copia se encuentra en todos los afectados en mayor o menor medida. De hecho, la corrección del gen SMN2 con el empalme del exón 7 ha demostrado conferir beneficios terapéuticos en modelos de ratón que sufren AME.

Numerosos equipos de investigación han realizado ensayos para determinar el efecto de diversos compuestos que se han sugerido como activadores farmacológicos de la expresión del gen SMN2. Las principales moléculas utilizadas son los oligonucleótidos antisentido (ASO): fragmentos de RNA producidos in vitro que son capaces de unirse al mRNA natural y modificar su proceso de splicing. El primer fármaco aprobado para AME, Nusinersen (Spinraza™), es un ASO que promueve la inclusión del exón 7 de SMN2 secuestrando un elemento cis inhibidor llamado Silencer de empalme intrónico N1 o ISS-N1. Un punto a favor de esta nueva línea de investigación es que el promotor del gen SMN2 presenta varios sitios de unión para factores de transcripción importantes para la supervivencia y diferenciación de las motoneuronas, y dichos sitios pueden ser utilizados como dianas de los fármacos desarrollados para alterar el proceso de corte y empalme del gen SMN2.

Figura 7: Comparativa de la producción de proteína SMN en personas sanas (A), pacientes de AME (B) y pacientes de AME tratados con ASO (C). Tomada de Romancing the Spliceosome to Fight Spinal Muscular Atrophy por Kathryn J. Swoboda (https://doi.org/10.1056/NEJMcibr1409795)

Hoy en día se mantiene la esperanza de que se evalúen nuevos fármacos en ensayos clínicos con AME y que la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos) admita su uso para pacientes humanos. Una cosa está clara, y es que la situación genética única en la especie humana para la AME, en la que se da la existencia de una segunda copia del gen (SMN2) capaz de compensar los síntomas graves de la enfermedad, anima a los investigadoras a luchar por la búsqueda de nuevos tratamientos.


BIBLIOGRAFÍA:

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