INTEGRINAS: ITGβ3 Y EL CÁNCER.

Por Julia Burgos Flores, Paola Blanco Montes y Ester Castellanos Caro.

Grado en Biología Sanitaria, Universidad de Alcalá.

INTRODUCCIÓN:

Las integrinas son un tipo de proteínas que actúan como moléculas de adhesión celular permitiendo la unión de la célula con las proteínas de la matriz extracelular.Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. (2001). 

Son los principales receptores en metazoos. Además de mediar las interacciones célula- matriz en vertebrados también realizan la unión célula-célula al interaccionar con el citoesqueleto.

Es decir, las integrinas generan conexiones transmembranales y proporcionan a la célula una forma de comunicarse e interaccionar con el medio en el que se encuentra. “Integran el interior celular (citoesqueleto) con el exterior”. Hynes, R. O. (2002). 

Desde su descubrimiento en 1987, su profundo estudio nos ha llevado a entender su papel clave en procesos como la señalización celular y la regulación de la proliferación, apoptosis y la migración celular.

La relación entre las integrinas y estos procesos reside en que las señales intracelulares que los inician son transducidas mediante componentes citoplasmáticos que han sido identificados como proteínas asociadas a integrinas.Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. (2001). 

Los últimos estudios también relacionan estas proteínas clave con las respuestas inmunitarias y el tráfico leucocitos, homeostasis, enfermedades del corazón, trombosis y en la metástasis y el cáncer, como la ITGβ3. Hynes, R. O. (2002). 

FAMILIA DE INTEGRINAS: 

La familia de integrinas consta de 8 subunidades β que pueden combinarse con 18 subunidades α para formar 24 integrinas distintas. 

Estos receptores de adhesión transmembranales estructuralmente son heterodímeros glicosilados,  formados por la unión no covalente de las subunidades α y β. Esta unión es la que marca la especifidad de unión a uno u otro ligando. Entre los ligandos podríamos mencionar los inhibidores de agregación plaquetaria y virus como el adenovirus o echovirus.

Cada subunidad atraviesa la membrana una vez. La mayor parte de cada polipéptido queda en el espacio extracelular y dos dominios cortos quedan en el citoplasma. Hynes, R. O. (2002). 

Figura 1. Imagen simplificada de los dominios transmembrana heterodiméricos que muestran cómo las integrinas están diseñadas para actuar en procesos de señalización.
Están formados por subunidades α (rojo) y β (verde). Los dominios extracelulares interaccionan con la matriz extracelular (ECM), compuesta por fibronectina y colágeno. Los dominios citoesqueléticos de ambas subunidades también interaccionan entre ellos (morado) y con la actina. Presentan un extremo N- terminal que les permite int
eraccionar con ligandos (amarillos).
Creada por Paola Blanco. 

Las integrinas son una familia de proteínas que solo aparecen en metazoos (no hay homólogos en hongos, procariotas…) incluso en los cnidarios y poríferos más simples. Están muy conservadas en la evolución, pues los organismos diblásticos más primitivos ya presentaban el heterodímero alfa beta que persiste hasta nuestros días. 

Como cabe esperar, han ido apareciendo variantes de creciente complejidad, de las cuales muchas comparten la unión al mismo ligando, causando una redundancia funcional. Sin embargo, la pérdida de alguna de estas subunidades ha resultado ser causante de muchos defectos biológicos en modelos de ratones KNOCKOUT (principalmente de la subunidad  β1 que se combina con diferentes subunidades α).

Debemos tener en cuenta también que para permitir la adhesión celular-matriz en los metazoos, a medida que evolucionaron los organismos diblásticos, las dos capas celulares pueden haber desarrollado integrinas separadas para mediar sus interacciones asimétricas con la lámina basal. Hynes, R. O. (2002). 

Las modificaciones postraduccionales y el procesamiento del ARNm son los principales agentes que aumentan la diversidad de esta familia de proteínas. Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. (2001). 

Podemos dividir a esta familia en dos grupos: 

Hay un grupo de integrinas, los receptores de la secuencia tripéptidica RGD (Arg-Gly-Asp). Estos receptores se unen a componentes de la matriz que contienen esta secuencia, principalmente fibronectina, vitronectina. La matriz extracelular es una red compleja compuesta por proteínas de alto peso molecular (colágeno, y laminina entre otras), proporcionando soporte estructural a las células y actuando como una barrera selectiva.  

El colágeno y la laminina también contienen RGD, pero en zonas inaccesibles. Estás son reconocidas por otras subunidades α que median la adhesión a la lámina de la membrana basal. Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. (2001).

 

Figura 2. En esta imagen se pueden observar las diferentes subfamilias de integrinas y sus relaciones evolutivas. se aprecia como la subunidad β1 es clave para interaccionar con el resto de subunidades.
Distinguimos heterodímeros que interactúan con la matriz: bien actúan como receptores de colágeno (gris) o tienen especificidad para lamininas (violeta).
También se representan los receptores RGD (azul), que se encuentran a lo largo de los metazoos y son las más antiguas. Por el contrario, las subunidades α están restringidas a cordados, al igual que α4 y α9 (verde) y las subunidades β2-β8.
Figura tomada de Hynes, R. O. (2002). Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. cell, 110(6), 673-687.

ACTIVACIÓN DE LAS INTEGRINAS:

Muchas integrinas se expresan en las superficies celulares en un estado inactivo en el que presentan una afinidad baja por el ligando (no se unen y no emiten señales). Hynes, R. O. (2002). 

El dominio citoplasmático de las subunidades α inhibe la interacción de las beta con los componentes del citoesqueleto. Estas pueden ser activadas por agonistas mediante eventos de señalización “de dentro a fuera”, que inducirían un cambio conformacional que separa los dominios α y β. Es muy importante que las células regulen su adhesión de forma temporal durante procesos como la migración celular. Por otra parte la agrupación de integrinas (clustering), que también aumenta la afinidad con el ligando, está regulada por las fibras de actina del citoesqueleto. Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. (2001). 

También debemos tener en cuenta que las integrinas suelen intercomunicarse, activando o inhibiendo a otras integrinas o moléculas de adhesión celular. Por ejemplo, se ha demostrado que las integrinas están implicadas en la regulación de la actividad de cadherinas durante la migración de células, sugiriendo la existencia de un antagonismo entre ambas. Esto ocurre durante etapas específicas del desarrollo embrionario pero también bajo ciertas condiciones patológicas, como en la pérdida de polaridad epitelial en células de tumores de mama. Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. (2001). 

Un ejemplo de la importancia de la activación de las integrinas es la integrina αIIbβ3 de leucocitos y plaquetas, que requieren una activación inducida por agonistas como la epinefrina para unirse a su ligando. Se encuentra inactiva en el líquido circulante, ya que de no ser así se unirían al fibrógeno, su ligando principal, provocando trombosis. Hynes, R. O. (2002). 

Otro ejemplo es el de la subunidad de integrinas β2 que se expresan en la mayoría de los glóbulos blancos. Cuando los leucocitos están «en reposo» estas integrinas se vuelven inactivas y cuando se activan, por ejemplo por las citoquinas, las integrinas β2 se vuelven adhesivas para sus contrarreceptores (en este caso las inmunoglobinas) desarrollando una función inmunológica.

Estos se expresan en las células endoteliales, lo que permite la unión de los leucocitos a la pared del vaso, o en otras células, dando lugar a fenómenos como la fagocitosis, la destrucción citotóxica o la ayuda de los linfocitos. Del mismo modo es importante que estén inactivadas para evitar la inflamación. Hynes, R. O. (2002). 

ESTRUCTURA Y MECANISMO GENERAL DE LAS INTEGRINAS

Como ya se ha mencionado, las integrinas pertenecen a una familia de α,β receptores de heterodímeros que participan en la dinámica de unión con moléculas extracelulares y actina del citoesqueleto intracelular. (Campbell, I. D, & Humphries, M. J., 2011). Se producen asociaciones αβ; en las que 8 subunidades beta pueden agruparse con 18 subunidades alfa para formar los 24 tipos de integrinas diferentes y su interacción con ARNm aumenta aún más la diversidad de esta familia proteica. (Van der Flier, A., & Sonnenberg, A. , 2001). 

Cada subunidad contiene un largo dominio extracelular que posee la mayor parte de polipéptidos ubicados en el espacio extracelular, alrededor de 1600 aminoácidos, los cuales interactúan con los ligandos correspondientes para iniciar procesos de señalización celular; un dominio transmembranal que atraviesa la membrana; y una corta cola citoplasmática con dos dominios más pequeños, de unos 20-50 aminoácidos. (Hynes, R.O, 2002). 

Estos dominios inician el ensamblaje de señales complejas y actúan como puente de la matriz con el citoesqueleto. Para que esto tenga lugar, este mecanismo se halla fuertemente regulado mediante un mecanismo de receptores, para que tengan lugar cambios en su estructura terciaria y cuaternaria que activan la proteína (Humphries, M. J , 2000). 

  • Dominio extracelular.

Los dominios extracelulares son por lo general grandes. La porción extracelular de las subunidades α y β  se compone de varios subdominios organizados en un dominio globular de la cabeza N-terminal que se une a un ligando. Este dominio globular se sostiene sobre dos largas y extendidas “patas” C-terminales que se conectan a la transmembrana y a los dominios citoplasmáticos de cada subunidad respectivamente.

La mitad de las subunidades α contienen un dominio adicional (I) de 200 aminoácidos que se inserta dentro del dominio de hélice β . Cuando está presente, el α I-dominio representa el sitio exclusivo de unión extracelular para los ligandos y contiene un conservado «sitio adhesivo dependiente de iones metálicos» (MIDAS) que se une a cationes metálicos divalentes (Mg2+), que juega un papel importante en la unión de ligandos de proteínas. La unión altera la coordinación del ion metálico y desplaza el dominio I de un estado de reposo cerrado a una conformación abierta y activa que resulta en un aumento de la afinidad del ligando y promueve la posterior activación de integrina.

Figura 3. Dominio extracelular de la integrina alphabeta3, compuesta por alfa hélices (rojo), láminas beta (morado) y la coordinación con un ion metálico (Mn2+ en verde y rodeado por un círculo verde) que forma la zona MIDAS para la unión con el ligando.
Creada a partir del PBD: 1m1x.

Por otro lado, la subunidad β juega un papel importante en la unión de ligandos en subunidades α que carecen del dominio I. Los ligandos se unen a una grieta en el dominio de la cabeza entre las subunidades αβ e interactúan con un MIDAS ocupado por iones metálicos. (Srichai, M. B., & Zent, R. , 2010). 

  • Dominio transmembranal (TM).

Es una estructura de expansión simple compuesta de 25-29 residuos de aminoácidos que forman bobinas helicoidales α que homo o heterodimerizan (Adair y Yeager, 2002). En el caso del dominio β3 transmembranal es una hélice lineal α de 30 residuos que es algo más larga que el ancho de una bicapa lipídica típica, lo que implica que una inclinación pronunciada de la hélice está presente dentro de la membrana plasmática (Lau et al. 2008). Las subunidades inactivas de integrina TM están fuertemente empaquetadas.

(Srichai, M. B., & Zent, R., 2010).

  • Dominio citoplasmático.

Estos dominios son generalmente pequeños, en gran parte no estructurados y compuestos de 10-70 residuos de aminoácidos. Las β colas citoplasmáticas son altamente homólogas, mientras que α subunidades colas son muy divergentes.

Figura 4. Dominio citoplasmático de la integrina beta 3 con α hélices (en rojo). Creada a partir del PDB: 1s4x

En las regiones proximales de membrana de las subunidades α y β,  se forma un puente de sal entre arginina de la subunidad α y ácido aspártico de la subunidad β (Adair y Yeager, 2002; Vinogradova et al. 2000). Este puente de sal representa una interacción física entre αΙΙβ y β3 colas citoplásmicas. Se cree que el puente de sal funciona para mantener las integrinas en el estado inactivo de baja afinidad. La interrupción del puente de sal en las integrinas β3 ha demostrado desempeñar un papel clave en la regulación de los estados de activación (Hughes et al., 1995, 1996).

Figura 5. Estructura de las regiones proximales de la membrana de las subunidades αIIb (izquierda) y β3 (derecha). Entre ellas se producirá el puente salino en el que participan la arginina (azul) y el ácido aspártico (amarillo).
Creada a partir del PDB: 1kup.

Dentro de las colas de β integrina hay dos motivos bien definidos: un NpxY proximal de membrana y un motivo NxxY distal de membrana. Estos motivos representan secuencias de reconocimiento canónico para dominios de unión a la fosfotirosina (PTB) (Calderwood et al. 2003) y sirven como sitios de unión para múltiples proteínas de unión a la integrina.

Cabe mencionar que tanto para los dominios TM como los citoplasmáticos, no se han resuelto sus estructuras cristalinas mediante rayos X de alta resolución, por lo que gran parte de la información estructural se basa en datos de RMN (resonancia magnética nuclear). De esta forma, no poseemos las estructuras proteicas de “Chimera” del dominio transmembranal, entre otras estructuras. (Srichai, M. B., & Zent, R. , 2010).

PAPEL BIOLÓGICO Y BIOMÉDICO

La metástasis o diseminación metastásica consiste en la migración de células de un tumor primario, que infiltra tejidos vecinos, además de establecer nuevos focos tumorales. Ocurre como consecuencia del potencial invasivo que adquieren algunas células cancerígenas debido a su adaptación a nuevos entornos por cambios genéticos. (Arvelo, F., & Poupon, M. F. ,2001).

Representa el 90% de los fallecimientos por cáncer. Conlleva varias etapas, siendo la última la colonización de un entorno nuevo. (Fuentes, P., Sesé, M., Guijarro, P. J., Emperador, M., Sánchez-Redondo, S., Peinado, H., … & y Cajal, S. R. ,2020). 

La metástasis ósea es una de las complicaciones del cáncer de mama más común, ya que ocurre en el 70% de los pacientes. Esto incrementa el dolor, las fracturas y la alteración de la hematopoiesis debido a la infiltración de médula ósea, entre otras consecuencias destructoras. (Roodman 2004; Uccello et al. 2011). (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R. ,2021). 

La integrina β3 (ITGB3) tiene un papel importante en el cáncer de mama, ya que seguramente esté relacionado con la metástasis del músculo esquelético. 

El objetivo del estudio hecho por Marineta Kovacheva, Michael Zepp, Stefan Berger y Martin R. Berger era averiguar qué papel jugaba la integrina como fin de la terapia anti metastásica. En la investigación se generaron dos células clones de MDA-MB-231 con eliminación condicional de ITGB3 mediado por miRNA para analizar el impacto de la metástasis en siete ratas, que recibieron doxiciclina vía agua. Los resultados in vitro mostrarían el efecto de la expresión y migración del mRNA. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R., 2021). 

La doxiciclina es un isómero estructural de la tetraciclina, utilizado en medicina desde 1966. Se obtiene de forma semisintética a partir de oxitetraciclina o metaciclina. Es un antimicrobiano. (Riond, J. L., & Riviere, J. E. ,1988).

MDA-MB-231 se utiliza como una línea celular de cáncer de mama altamente invasiva. (López-Naranjo F, Ávila-Álvarez EP, Guadarrama-Flores B). El miRNA (microRNA) es un RNA pequeño no codificante, que acentúa la degradación de mRNA e inhibe la traducción post-transcripcional. Además, contribuye a la tumorigénesis y metástasis cancerígena. (Bavelloni, A., Ramazzotti, G., Poli, A., Piazzi, M., Focaccia, E., Blalock, W., & Faenza, I. , 2017). miRNA let-7a es un regulador importante de la expresión de ITGB3, ya que la pérdida de este implica el desarrollo de cáncer. (Müller, D. W., & Bosserhoff, A. K. , 2008). 

La eliminación (knockdown) de la Integrina Beta3 se estableció de forma condicional, y no permanente o transitoria para evitar las desventajas de estos modelos. El knockout permanente podría derivar en la supervivencia de las células tumorales, mientras que el transitorio solo inhibiría la proteína a corto plazo. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R, 2021). 

Además, se analizaron los niveles de Integrina Beta 3 in vitro e in vivo en varias condiciones: en exosomas del plasma de ratas con metástasis esquelética, en las células MDA-MB-231 incubadas en exosomas y en exosomas secretados por células con eliminación de esta Integrina. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R., 2021). 

Los exosomas son una clase de vesículas extracelulares liberadas por todo tipo de células, que contienen proteínas, DNA, RNA… Funcionan como “recogedores” de aquellas sustancias en exceso o de desecho. Asimismo, facilitan la formación de tumores, mediante la regulación de metástasis. (Kalluri, R. , 2016). 

Como consecuencia de la inhibición de la expresión de Integrina Beta 3 in vivo, la proliferación y migración de estas células malignas disminuyó. Esto supuso la reducción de las lesiones osteolíticas. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R. (2021). El cáncer de mama está relacionado con la metástasis ósea osteolítica, en la que los osteoclastos destruyen el tejido óseo. (Kitazawa, S., & Kitazawa, R. , 2002). Los osteoclastos son, a priori, células que restauran huesos. Son los únicos capaces de reabsorber la matriz ósea calcificada. (Arboleya, L., & Castañeda, S., 2014). 

También se pudo observar en el estudio que los niveles de Integrina Beta 3 aumentaron en dos ocasiones: en los exosomas apartados de plasma de rata que retenían lesiones de MDA-MB-23, así como en células incubadas in vitro con exosomas; mientras que se redujo en los exosomas de células en las que se había eliminado condicionalmente ITGB3. 

Estos efectos de aumento y disminución del nivel de esta integrina se pueden explicar por el decrecimiento o regulación a la baja (downregulation) de genes específicos, que participan en: angiogénesis, crecimiento tumoral, metabolismo energético, citocinesis, migración y proliferación celular, invasividad, senescencia, tumorigénesis y tráfico vesicular. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R. , 2021). 

Como conclusión y tras el estudio realizado en 2020 por científicos del Centro Alemán de Investigación del Cáncer y del Instituto Central de Salud Mental, ITGB3 participa activamente en la metástasis esquelética del cáncer de mama, ya que es capaz de modular la expresión génica, lo que da pie a que se convierta en un posible objetivo para la terapia anti metastásica. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R., 2021). 

Tras la investigación del efecto de ITGB3 en otros carcinomas, como el de vejiga, se concluyó que miR-320a contribuye a la invasión de células T24 por la downregulation de la expresión de ITGB3 en TCC (transitional cell carcinomas), ya que ITGB3 es un objetivo específico de miR-320a. (Kovacheva, M., Zepp, M., Berger, S., & Berger, M. R. , 2021). 

Por otro lado, un estudio de Marta Emperador, Stefan Hümmer et al., en colaboración con Vall d´Hebron Institute of Oncology (Barcelona), la Universitat Autònoma de Barcelona, el CIBERONC y el CNIO, concluyó que la Integrina Beta 3 favorece el crecimiento tumoral, ya que las células tumorales captan vesículas del exterior gracias a ella. Si se inhibe la ITGB3, la vesícula no es capaz de entrar en otros tejidos, y por lo tanto, se evitaría la metástasis, en la que es fundamental la interacción con el medio.

Existe una serie de vesículas extracelulares que secretan el tumor primario, cuyas moléculas hacen que se desarrolle el tumor mediante la modificación del entorno. Las vesículas extracelulares que se han secretado por los tumores primarios son capaces de modificar el ambiente, tanto próximo como lejano, de tal forma que se produzca la evolución de los tumores primarios, así como el establecimiento de nichos pre-metastásicos o la diseminación. (Fuentes, P., Sesé, M., Guijarro, P. J., Emperador, M., Sánchez-Redondo, S., Peinado, H., … & y Cajal, S. R., 2020). 

BIBLIOGRAFÍA

INTRODUCCIÓN

ESTRUCTURA

CÓDIGOS PDB. (estructuras Chimera).

  • 1kup → solution structure of the membrane proximal regions of apha-IIb and beta3 integrins. 
  • 1m1x → crystal structure of the extracellular segment of integrin aphabeta3 bound to Mn2 +.
  • 1s4x → NMR structure of the integrin B3 cytoplasmic domain in DPC micelles.

PAPEL BIOLÓGICO Y BIOMÉDICO.