Realizado por Natalia López Escobar y Pablo Martín Valenzuela.

Biología molecular. 3º Biología Sanitaria. Grupo C.

1. Introducción

Actualmente, existen diversas terapias frente al cáncer, por un lado, las tradicionales, donde encontraríamos la quimioterapia, la cirugía y la radioterapia; y por el otro, las de nueva incorporación, donde nos encontraríamos la terapia dirigida, la inmunoterapia y la terapia hormonal láser entre otras.

Una de las líneas de investigación más recientes frente al cáncer es el uso de virus oncolíticos. Estos virus son modificados genéticamente para reconocer al cáncer e infectarlo. Gracias a esto, no sólo conseguimos que las células del tumor infectadas mueran, si no que permite, además, una activación del sistema inmune del hospedador. Al lisar a las células tumorales, se liberan antígenos que serán reconocidos por células del sistema inmune que activarán la respuesta inmune.

1.1. El cáncer

El cáncer es un conjunto de enfermedades que se presentan cuando las células se multiplican sin control y se diseminan a los tejidos que los rodean. Las características que deben cumplir las células para ser consideradas células tumorales fueron descritas en 2011 por Hanahah y Weinberg (1 y 2). Estas características son:

• Autosuficiencia de señales de crecimiento, es decir, no necesitan señales externas para crecer.
• Insensibilidad a señales antiproliferativas.
• Evasión de la apoptosis.
• Adaptación metabólica.
• Inmortalización, mediante el alargamiento de los telomeros
• Capacidad de invasión y angiogénesis, es decir, capacidad de crear nuevos vasos sanguíneos.
• Capacidad de colonización de otros tejidos (metástasis).
• Evasión de la respuesta inmune

1.2. Los virus oncolíticos

La idea de que los virus pueden ser utilizados contra el cáncer no es novedosa, proviene de mediados del siglo XX, cuando se observaron, en pacientes con linfomas y leucemias, remisiones del tumor, coincidentes con infecciones por virus, como el de la hepatitis o el del sarampión (3). Se empezó entonces a probar la infección de pacientes oncológicos con virus. No tuvo la eficacia esperada y además, se encontraron muchos efectos secundarios causados por los virus, de modo que se detuvo la investigación (4).

Ahora, gracias a los avances de la ingeniería genética, se han podido desarrollar virus oncolíticos más seguros y específicos frente a determinados tipos de tumores.

2. Mecanismos moleculares de acción

Los virus oncolíticos son capaces de infectar células anormales a través de dianas celulares específicas: Transcriptasa inversa de telomerasa humana, antígeno específico de próstata, ciclooxigenasa-20, her2/neu…

• La Transcriptasa inversa de telomerasa humana o hTERT, es una subunidad catalítica de la enzima Telomerasa. La telomerasa es una polimerasa ribonucleoproteica, que mantiene los extremos de los telomeros. No puede ser considerado un protooncogén, ya que su mutación por sí sola no induce el crecimiento. Si que es importante su papel en la inmortalización de las células tumorales. La mutación en el promotor de hTERT confiere una mayor agresividad al melanoma (5)
• HER2/neu: es un tipo de HER (Human EGF Receptor). Es un receptor con actividad Tyr quinasa, que tiene como ligando EGF (Epidermal Growth Factor). HER2 tiene un peculiaridad, ya que presenta la capacidad de activarse sin necesidad de ligando. Se ha visto su sobreexpresión hasta en el 30% de los cánceres de mama. (6 y 7)

Una vez hemos visto ejemplos de algunas dianas que pueden usar los virus para reconocer a las células tumorales, podemos ver los mecanismos que producen la muerte del tumor. La infección viral provoca, en primer lugar, la lisis de células tumorales. Las células dendríticas, reconocen antígenos virales y estimulan la producción de Interferon de tipo I, factor de necrosis tumoral alfa. (TNF-α) y citoquinas como la interleucina 2 (IL-2). El TNF-α regula la expresión del complejo de histocompatibilidad, e influye positivamente en la acción de la enzima caspasa y contribuye a la apoptosis celular en algunos tumores. Además, está molécula está relacionada con la activación de los linfocitos T citotóxicos y las células NK. Por lo tanto, conseguimos la muerte de las células tumorales mediante dos modos: por un lado, la lisis celular provocada por el ciclo de infección del virus. (8)

Una de las principales ventajas que supone el uso de virus oncolíticos es que podría inducir regresión en casos de metástasis (que representan la mayor parte de las muertes por cáncer) ya que, al provocar la lisis celular, salen nuevas partículas virales que pueden viajar hacia zonas lejanas donde haya metástasis. Pero el mecanismo más importante son las nuevas respuestas inflamatorias, que se producen cuando se lisan las células tumorales y salen antígenos al exterior. Estas nuevas respuestas inflamatorias, unidas a la memoria inmune celular, pueden provocar la regresión de las metástasis. (8)

Uno de los virus oncolíticos más prometedores es el CTV-m7, el cual incrementa la acción citotóxica sobre el tumor y es capaz de lisar células metastásicas. Se ha probado su uso en cánceres de próstata y ha demostrado efectividad (9).

Hay un único virus oncolítico aprobado por la FDA, es el T-VEC (Imlygic®), que es el virus del herpes simple (VHS), modificado para atacar a las células cancerígenas del melanoma.

3. Virus de la Enfermedad de Newcastle como nueva aproximación terapéutica para el glioblastoma

3.1. Introducción

Vamos a poner un ejemplo de un estudio que se realizó sobre el virus de la enfermedad de Newcastle, para ver si es adecuado para usarlo como virus oncolítico y como terapia para el glioblastoma.

3.1.1. Glioblastoma (GBM)

El glioblastoma es el tumor cerebral más común en el SNC, siendo muy agresivo debido a su invasividad y alta proliferación. Las personas que lo padecen tienen una esperanza de vida muy corta una vez que se diagnostica, a pesar de la mejora de los tratamientos y establecimiento de terapias.

Este tumor, compuesto por células madre de glioma (GSCs), presenta resistencia a diferentes tratamientos contra el cáncer, como la quimio o la radioterapia, ya que estas células son capaces de autorrenovarse y diferenciarse (10). Las GSCs se cree que también son las causantes de la recurrencia del glioblastoma.

Los rasgos más característicos de este cáncer son la proliferación microvascular y la necrosis, es decir, se agrupan en capas y las células presentan la zona central con necrosis (11).

3.1.2. Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV)

Es un virus aviar, con propiedades oncolíticas e inmunoestimuladoras, por lo que su estudio en viroterapia y ensayos clínicos cada vez es mayor.

El genoma de este virus consiste en una molécula de ARN monocatenario, con polaridad negativa  y formada por dos regiones en los extremos, leader en 3’ y tráiler en 5’, no codificantes; y seis genes que codifican 6 tipos de proteínas diferentes (12).

Infecta células y se replica en ellas, destruyéndolas. Esto lo hace más rápido en las células cancerosas humanas, de ahí el interés en su estudio como tratamiento para el cáncer. Presenta dos cepas: las cepas líticas, que dañan la membrana de la célula; y las cepas no líticas que bloquea el metabolismo de la célula. Las cepas líticas son las que se estudian para el cáncer, ya que son capaces de eliminar directamente las células cancerosas; pero las dos cepas se usan en vacunas que ayudan al sistema inmune a combatir el cáncer (13).

Los cultivos que se realizaron con GSCs y rNDV muestran como este virus afecta a la viabilidad de las células del tumor, induciendo apoptosis.

3.2. Glioblastoma: aspectos moleculares y patología

Las vías de señalización, moléculas y genes más comúnmente afectadas en el GBM, que hacen que sea resistentes a los tratamientos convencionales (14), son:

• Receptores tirosina/quinasa (RTK): se encuentran en la membrana plasmática. Se autofosforilan en presencia de ligando para activarse. Se encargan de activar vías de transducción que continúan con vías de transcripción de genes que regulan el ciclo celular.

• Vía de PI3K/AKT/mTOR: PI3K activa a AKT y este activa a mTOR, relacionado con la supervivencia y el ciclo celular. 

• Señalización de RAS/MAPK: genes transcritos por vías de traducción llevadas a cabo por segundos mensajeros (oncogenes o genes supresores de tumores), que participan en la proliferación celular. RAS es una GTPasa que actúa en la transducción de señal de RTK. Cuando se activan RTK, se activa RAS, que a su vez activa la vía de transducción de las MAPK. Las mutaciones en RAS la activan permanentemente, activando también permanentemente la vía de las MAPK. Esto induce una transcripción activa de genes relacionados con el ciclo celular.

• P53 y retinoblastoma (RB): implicadas en regulación del ciclo celular. P53 es un gen supresor que se encarga de inducir apoptosis cuando el ADN está dado. Si p53 está mutado, se sigue con el ciclo celular y el daño en el ADN. También inhibe a mTOR, relacionado con el ciclo celular. El retinoblastoma está relacionado con la mutación de pRb, que hace que no se una a E2F y se siga con el ciclo celular.

• Gen EGFR: es el gen del receptor del factor de crecimiento epitelial (GFR). Si está alterado, se hace independiente de EGF, por lo que se activa a muy bajas concentraciones de ligando.

3.3. NDV como agente oncolítico

En 1965 observó por 1ª vez que NDV presentaba un efecto antitumoral y baja neuroafinidad. Este potencial oncolítico que presenta el virus se debe a su propia capacidad de replicarse bastante mejor (unas 10⁴ veces mejor) en las células tumorales que en las células normales, y además, sin afectar a las células sanas. Además, al ser un virus aviar, sus cepas virulentas provocan solo síntomas leves.

3.3.1. Mecanismo de oncólisis de NDV

NDV se asocia principalmente a la inducción de la apoptosis. La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que ocurre en todos los tipos celulares. Además, también puede provocar necroptosis, que es un tipo de muerte celular que tiene características tanto de necrosis (por la morfología de las células) como de apoptosis (por lo de programada). También puede inducir la muerte celular por autofagia.

La infección por este virus induce la activación de la respuesta inmune, favoreciendo su efecto oncolítico. Las células tumorales infectadas presentan Ag virales, haciendo que las células de alrededor liberen citoquinas, que activan a macrófagos, NK y o monocitos, provocando la respuesta inmune innata; o haciendo que se activen las células presentadoras de Ag, que activan a los linfocitos T citotóxicos, que activarán la respuesta inmune adaptativa. Todo esto activa el estado de actividad inmunológica antitumoral causando la muerte celular inmunogénica de las células tumorales (15).

El genoma de este virus es muy fácil de modificar, por lo que la técnica de genética inversa es útil para obtener virus recombinantes, teniendo como objetivo aumentar su eficacia antitumoral.

Se han estudiado sus propiedades oncolíticas, dando en algunos casos reducción parcial y en otros total del tumor.

3.4. Resultados

La tesis concluye que el NDV induce cambios en la viabilidad de las GSCs, demostrando la capacidad oncolítica del virus en diferentes tipos de líneas celulares tumorales, incluidas las líneas tumorales de glioma. Además, interfiere en el crecimiento celular de las GSCs, y provoca la inducción de la apoptosis de las diferentes líneas celulares.

En cuanto a os xenotransplantes, también se observó que se reduce el tamaño de los tumores xenotransplantados en ratones Nude. Finalmente se demostró que en los ratones inmunodeprimidos, el virus causa 100% de mortalidad, siendo seguro solo para los ratones inmunocompetentes. Lo que puede suponer una importante limitación en el uso farmacológico del virus de la enfermedad de Newcastle.

4. Conclusión

Nos ha parecido un trabajo interesante y además hemos aprendido muchas cosas que no sabíamos y que nos han gustado mucho. Creemos que la investigación y el estudio de los virus como terapia para el cáncer es algo muy importante y que podría funcionar muy bien para solucionar el problema que provoca esta enfermedad. Si es verdad que aún queda mucho por avanzar, pero creemos firmemente, que de aquí a unos años esta nueva terapia será una opción más para combatir el cáncer.

5. Bibliografía

1. The Hallmarks of CancerHanahan D, Weinberg RCell (2000) 100(1) 57-70

2.  Conociendo y comprendiendo la célula cancerosa: Fisiopatología del cáncer Catherine Sánchez N. Revista Médica Clínica Las Condes (2013) 24(4) 553-562

3. Studies in Hodgkin’s syndrome; the association of viral hepatitis and Hodgkin’s disease; a preliminary report. HOSTER H, ZANES R, VON HAAM E. Cancer research (1949) 9(8) 473-80

4. Clinical studies of viruses as antineoplastic agents with particular reference to Egypt 101 virus. SOUTHAM C, MOORE A Cancer (1952) 5(5) 1025-34

5. Telomerase reverse transcriptase promoter mutations in primary cutaneous melanoma Heidenreich B, Nagore E, Rachakonda P, Garcia-Casado Z, Requena C, Traves V, Becker J, Soufir N, Hemminki K, Kumar R. Nature Communications (2014) 5(1) 3401

6. Homeostasis celular: crecimiento celular y cáncer – Bioquímica médica Michie, Alison M.; Paunovic, Verica; Harnett, Margaret M.; Bioquímica médica, Capítulo 28, 397-415

7. Introducción a la anatomía patológica – Wheater. Anatomía patológica O’Dowd, Geraldine, BSc(Hons), MBChB(Hons), FRCPath; Bell, Sarah, BSc Med Sci(Hons), MBChB(Hons), DipFMS, FRCPath; Wright, Sylvia, BSc(Hons), MBChB(Hons), FRCPath, DipFMS, PG Cert Mol Path; Wheater. Anatomía patológica, 1, 2-11

8. Santos Apolonio J, Lima de Souza Gonçalves V, Cordeiro Santos ML, Silva Luz M, Silva Souza JV, Rocha Pinheiro SL, de Souza WR, Sande Loureiro M, de Melo FF. Oncolytic virus therapy in cancer: A current review. World J Virol 2021; 10(5): 229-255

9. Therapy of prostate cancer using a novel cancer terminator virus and a small molecule BH-3 mimetic Sarkar S, Quinn B, Shen X, Dash R, Das S, Emdad L, Klibanov AWang X, Pellecchia M, Sarkar D, Fisher P Fisher POncotarget (2015) 6(13) 10712-10727

10. Piper K, DePledge L, Karsy M, Cobbs C. Glioma Stem Cells as Immunotherapeutic Targets: Advancements and Challenges.

11. Ohgaki and Kleihues, 2013; Perry and Wesseling, 2016; Urbanska et al., 2014

12. Marcos et al., 2005; Triosanti et al., 2018

13. Csatary LK, Eckhardt S, Bukosza I, Czegledi F, Fenyvesi C, Gergely P, Bodey B, Csatary CM. Attenuated veterinary virus vaccine for the treatment of cancer. Cancer Detect Prev. 1993;17(6):619-27.

13. Csatary LK, Moss RW, Beuth J, Töröcsik B, Szeberenyi J, Bakacs T. Beneficial treatment of patients with advanced cancer using a Newcastle disease virus vaccine (MTH-68/H). Anticancer Res. 1999 Jan-Feb;19(1B):635-8.

14. Crespo et al., 2015; Szopa et al., 2017

15. Matveeva et al., 2015; Zamarin and Palese, 2012ª

16. Virus de la Enfermedad de Newcastle como nueva aproximación terapéutica para el Glioblastoma, Rubio S (2018) 24-43

Por Andrea Rufat Verdú y Ana Verdugo Abril. Grado en Biología Sanitaria, Universidad de Alcalá

1. Alzheimer y su histopatología

2. Intervenciones terapéuticas

Los tratamientos disponibles hasta el momento para la EA pueden lograr una mejoría sintomática y en la calidad de vida de los pacientes, pero ninguno consigue revertir, frenar o curar la fatal progresión de la enfermedad [4].

2.1 Tratamientos farmacológicos

2.2 Otros remedios: antioxidantes, antiinflamatorios…

2.3 Inmunoterapias

3. Conclusiones

• Es imprescindible el estudio de la neuropatología del Alzheimer con el fin de valorar posibles dianas farmacológicas que nos permitan desarrollar futuros fármacos eficaces contra la enfermedad.

• A día de hoy no se conoce ningún fármaco aprobado capaz de mejorar la EA al 100%. Sin embargo, muchos pueden retrasar el progreso de la enfermedad, como lo son aquellos aprobados por la FDA (U.S Food and Drug Administration). Incluyendo en este grupo al Lecanemab como el último fármaco aprobado por dicha organización, capaz de reducir hasta un 27% el empeoramiento de la enfermedad del Alzheimer.

• La EA no se trata únicamente con la administración de medicinas, sino que también es importante que las personas que la padezcan adopten en su vida cotidiana hábitos saludables, como una dieta mediterránea o la incorporación de especias como la cúrcuma gracias a los efectos de la curcumina. Porque pese a que no tengan un gran efecto sobre el progreso de la enfermedad, son capaces de colaborar en su mejoría.

• La histopatología de la enfermedad de Alzheimer se debe principalmente a la formación de placas amiloides y ovillos neurofibrilares, los cuales son las principales dianas de los tratamientos de esta enfermedad. Sin embargo, la patogénesis de la EA también puede ser tratada consiguiendo un aumento de acetilcolina, disminuyendo el exceso de glutamato y fomentando la actividad antiinflamatoria de la microglía y suprimiendo la proinflamatoria.

• Cabe destacar que la inmunoterapia actualmente está en pleno desarrollo como una de las formas más efectivas para conseguir un tratamiento para la cura del Alzheimer. Por otro lado, es necesario seguir con la investigación en este campo ya que muchos de los anticuerpos monoclonales y vacunas que se han conseguido han fracasado en sus últimas fases de ensayo.

• No solo es necesario encontrar un buen tratamiento para la EA, sino que también hay que seguir investigando para contar con un diagnóstico temprano, ya que estos fármacos resultan más efectivos con una temprana administración.

4. Bibliografía

Ana Paola Cano Morris, María del Rosario García Sánchez, Luna Guerra Núñez. Biología Sanitaria, UAH.

Índice

¿Qué son los miRNA?

¿Cómo se forman?

¿Cómo funcionan?

Transporte de miRNA

miRNA en el ámbito clínco

Conclusión

Bibliografía

¿Qué son los miRNA?

Los microRNA son cadenas pequeñas de RNA no codificante formadas por unos 22 nucleótidos, que intervienen en la regulación de RNA. Al tener de diana a gran parte de los transcritos codificantes de proteínas, los miRNA están involucrados en casi todos los procesos patológicos y de desarrollo de organismos.

Algunos estudios plantean la hipótesis de que los miRNA provienen de una evolución de RNAs pequeños en eucariotas para suprimir material genético y transcritos no deseados.

¿Cómo se forman?

La mayoría de los miRNA son transcritos en el núcleo por la RNA polimerasa II como intrones o exones de RNAs no codificantes, siendo por tanto, su expresión regulada por factores de transcripción o reguladores epigenéticos. Como resultado se generará un primiRNA de unas 1000 bases que deberá sufrir una maduración hasta ser un miRNA funcional.

En estas secuencias aparecen pequeñas horquillas de unos 33-35 pares de bases en cuyos extremos hay un bucle y segmentos de cadena simple 5′ y 3′ que unirán las diferentes horquillas.

En el comienzo de la maduración participa la proteína Drosha, una endonucleasa RNasa-III cuya acción es sobre RNA de cadena doble, es decir, actuará directamente sobre la horquilla formada anteriormente. También colabora en este punto el cofactor DGCR8, cuya actividad principal es aumentar la interacción del Microprocesador que forman con el primiRNA.

Es importante que el tamaño de la horquilla sea regular para una correcta maduración. Este Microprocesador realiza un corte sobre el RNA de doble cadena aproximadamente a 11 pares de bases de la unión basal (lugar en el que comienza la doble cadena) y a 22 de la unión apical (lugar donde se sitúa el loop terminal de la horquilla). Si como hemos dicho antes, la horquilla tiene un tamaño de entre 33-35 pares de bases, el Microprocesador realizará un corte en el sitio correcto y se formará un premiRNA; este corte no es perfecto, sino que deja en el extremo 3′ dos nucleótidos de más que quedan desapareados. Es importante que esta nueva molécula también tenga en su extremo 5′ un monofosfato; ambas estructuras permitirán la correcta interacción con el resto de proteínas. El Microprocesador es susceptible de modificaciones que regulen tanto su expresión como su función, pudiendo ser la formación de miRNAs regulada en múltiples puntos.

Una vez formado el premiRNA el resto de su maduración se realizará en el citoplasma. El exporte de la molécula es llevado a cabo por la proteína Exportina 5 (EXP5), que reconoce la estructura del RNA de doble cadena e interacciona con el saliente en su extremo 3′. Se forma un complejo en forma de canasta con la proteína RAN-GTP y el premiRNA que interacciona con el poro nuclear. El GTP es hidrolizado después de la translocación del complejo, de forma que este se desensambla y el premiRNA queda libre en el citoplasma. En algunos tumores la proteína EXP5 está truncada por una mutación en el gen que la codifica, impidiendo la maduración de miRNAs.

En el siguiente paso de la maduración, interviene la proteína Dicer acompañada de la proteína TRBP que aumenta su eficacia. Dicer, al igual que Drosha, es una endonucleasa RNasa III cuya función es realizar un corte en el premiRNA cerca del loop terminal de la horquilla. Así se liberará una corta cadena de RNA duplexo de unos 22 pares de bases, que será el futuro miRNA. La proteína Dicer necesitará de los extremos 5′ fosforilado y 3′ desapareado para su correcta interacción y funcionamiento.

La pequeña doble cadena de RNA se asocia a continuación con a proteína AGO, formando el complejo silenciador inducido por RNA (RISC). Será otra vez necesario que los extremos 5′ y 3′ estén correctamente formados para una apropiada interacción con la proteína. Para la carga del miRNA en la proteína AGO, es necesaria la formación un complejo intermedio denominado RLC compuesto por el miRNA, la proteína Dicer explicada antes y la nueva AGO. En humanos existen hasta 4 tipos de la proteína AGO, pero se unen indistintamente a los miRNAs para la formación del complejo.

Por el momento seguimos teniendo el miRNA como una cadena doble, por lo que debemos referirnos al complejo como pre-RISC. Por último, se deberá eliminar la cadena que no vaya a funcionar como guía en el complejo por medio de la endonucleasa C3PO, teniendo ya así el complejo RISC con un miRNA funcional. La selección de la cadena guía se realiza en función de la estabilidad termodinámica de los extremos de la cadena, normalmente es elegida la que posee un extremo 5′ menos estable; la cadena descartada será rápidamente degradada (será una pequeña cadena de RNA sin ningún tipo de protección). No siempre es elegida la misma cadena, ya que existe cierta preferencia hacia una de ellas en un 96-99% de los casos. La cadena de miRNA menos frecuente, aún siendo también activa, será menos efectiva y aparece señalada como miRNA*.

Se acaba de explicar el funcionamiento de la biogénesis de miRNA de forma canónica. Por el contrario, no es la única vía y existen otras vías alternativas. Destacaremos los mirtrons, los cuales se forman desde los intrones de mRNAs inmaduros y también forman una horquilla; producto del splicing que sufren los mRNA en su maduración. Estas secuencias de RNA serán similares a premiRNA y se introducirán en el proceso de síntesis de miRNA habiéndose saltado el procesamiento por Drosha y DGCR8.

¿Cómo funcionan?

Como se ha adelantado antes, la complementariedad de bases entre el complejo RISC y el mRNA a regular es crucial para que el miRNA pueda llevar a cabo su función. La regulación del producto codificado por el mRNA en cuestión puede llevarse a cabo por dos vías:

• Degradación del mensajero
• Represión de la traducción

Ambas dependerán en el grado de complementariedad al que se llegue entre el miRNA y el mRNA.

Principalmente interactúan los nucleótidos de 2-8 del miRNA, altamente conservados, en el extremo 5’ (conocida como secuencia “seed”) con la región 3’UTR del mRNA, aproximadamente 15 nucleótidos después del codón de paro y junto a una secuencia rica en AU. Actualmente se sabe que la secuencia diana puede también encontrarse en la región codificante (ORF) o 5’UTR, aunque menos frecuente y eficaz que la unión canónica.

Que sean esos nucleótidos presentados al mRNA no es algo casual, viene determinado por la disposición del complejo RISC que consigue presentar este fragmento concreto de la cadena guía en forma de hélice A, lo que aumenta la afinidad y especificidad con el mRNA. Se ha estudiado que un segmento mayor supondría un problema para la unión, mientras que uno menor no tendría la especificidad suficiente para su buen funcionamiento.

El miRNA debe estar totalmente cubierto por la proteína AGO para evitar su degradación por RNasas. Solo se muestra la secuencia “seed” que se unirá específicamente al mRNA. En este punto ocurre la represión de la traducción. Existen varias hipótesis sobre este mecanismo:

• Ralentización o paralización de los ribosomas en un punto posterior a la iniciación de la traducción.
• Marcaje del polipéptido para su posterior degradación
• Prevenir la interacción entre el promotor y su activador traduccional

Para que ocurra la degradación del mRNA es necesario alcanzar un grado mayor de complementariedad con el miRNA. Después de la unión típica del extremo 5’ hay un cambio conformacional del complejo que permite extender la interacción en las regiones central y 3’ de la cadena, después la proteína AGO vuelve a su conformación típica. Es en este momento cuando puede ocurrir la degradación, realizándose un corte entre los nucleótidos 10 y 11. Es la proteína AGO quien posee una actividad endonucleolítica capaz de realizar el corte. Los fragmentos del mRNA serán posteriormente degradados, mientras que el miRNA permanece intacto para poder seguir actuando.

En eucariotas, los complejos RISC se encuentran principalmente asociados a Cuerpos P, zonas electrodensas donde se acumulan enzimas implicadas en la degradación de mRNA, siendo así considerado un lugar para la regulación postranscripcional de mRNA.

Se sabe que existe una función cooperativa de los miRNA ya que aparecen múltiples sitios de unión a estas moléculas en los mRNA, multiplicando así las respuestas de cada sitio de unión trabajando por si mismo. De esta forma el mecanismo de acción es más sensible a cambios en los niveles de miRNA. Los miRNA que se unieran al mismo mRNA también podrían ser distintos, debiendo tener en cuenta todas las interacciones a la hora de determinar una patología o tratamiento.

Los miRNA normalmente no tienen un mensajero diana determinado, sino que pueden regular la expresión de varios genes. Esto es posible en primer lugar, gracias a la conservación de los sitios de unión en las regiones 3’UTR de modo que aparecen compartidos entre una familia de genes. Por otra parte, la complementariedad entre la región 3’UTR y el miRNA no es completa en la mayoría de casos, sino que solo se da en una pequeña secuencia de 7 nucleótidos, lo suficientemente corta como para poder estar en otros mRNA.

Transporte de miRNA

Tan importante como conocer su funcionamiento en el interior celular, es conocer su transmisión entre diferentes células. Dependiendo de los mecanismos de transporte intercelular que utilicen, su transmisión tendrá características diferentes, las cuales afectaran a los procesos fisiológicos y patológicos. En el caso de estos últimos, determinaran la capacidad de diseminación y extensión de la enfermedad en el organismo.

Las principales vías de comunicación intercelular son: la señalización dependiente de contacto célula-célula (uniones intercelulares), la señalización mediante moléculas solubles y la señalización mediante vesículas extracelulares.

En el caso de los miRNA se ha demostrado su transmisión mediante: microvesículas, HDL, lipoproteínas, riboproteínas, cuerpos apoptóticos, exosomas y gap junctions. Estos dos últimos procesos serán los que explicaremos en profundidad debido a la gran importancia que están teniendo en las últimas investigaciones sobre miRNA.

Gap-junctions

Son microdominios de la membrana plasmática de células adyacentes, en los cuales se encuentran conexinas (en los invertebrados se denominan inexinas) formando canales proteicos que permiten un intercambio rápido de sustancias entre ambas células mediante el transporte directo de moléculas de pequeño tamaño.

Diversos estudios han demostrado la existencia de un trasporte de miRNA desnudos, es decir, sin el complejo RISC. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo molecular de dicho transporte.

Exosomas:

Los exosomas fueron descritos por primera vez por Pan y Johnstone en 1983. Son vesículas extracelulares de entre 40 y 120 nm de diámetro constituidos por una bicapa lipídica. Pueden transportar moléculas como: lípidos, proteínas, RNA… Además, se han detectado en la mayoría de líquidos corporales, lo cual los convierte en potenciales biomarcadores para ciertas enfermedades.

La biogénesis de los exosomas se produce siguiendo el siguiente proceso: Primero se forman endosomas tempranos a partir de la invaginación de la membrana celular. Seguidamente, se generan invaginaciones de la membrana del endosoma, dando lugar a múltiples vesículas intraluminales (ILVs), lo que resulta en la formación de cuerpos multivesiculares (MVBs). El contenido es seleccionado e introducido en las ILVs, que cuando sean secretadas al exterior celular por exocitosis, pasarán a considerarse exosomas.

El mecanismo para la introducción de los miRNA en los exosomas aún no está completamente estudiado y descrito, siendo necesaria una mayor investigación en ese campo. Las cuatro vías que vamos a exponer a continuación han sido descritas en diversos estudios y actualmente son la principal hipótesis para explicar dicho proceso.

MiRNA en el ámbito clínico

Fallos en la regulación de la expresión y la función de los miRNA, ya sea por alteraciones genómicas o cambios en su biogénesis, han mostrado ser factores importantes en el desarrollo y la progresión de múltiples enfermedades.

Los miRNA son por lo tanto, un área de estudio importante para futuras técnicas de diagnóstico y tratamiento.

MiRNA como biomarcadores

Los miRNA tienen el potencial de ser el biomarcador perfecto; se expresan de forma ubicua, se pueden aislar fácilmente y cuantificar con gran sensibilidad y especificidad en tejidos o fluidos. Además, son estables, tienen especificidad celular y relevancia fisiológica en estados patológicos.

Sin embargo, aún no se logra una estandarización en cuanto a su análisis, y la expresión y función de los miRNA ha presentado variabilidad en distintas poblaciones.  

Los principales test de diagnostico en el mercado son útiles para distintos tipos de cáncer y enfermedades relacionadas con la edad, esto mediante el análisis de varios miRNA. Aun así, hay proyectos en desarrollo que se centran en los niveles de un único miRNA. 

En los últimos años, muchos estudios han propuesto el uso clínico de los exosomas con miRNA como posibles biomarcadores para la detección y seguimiento de enfermedades en las que participan. Esto se debe a las siguientes características de los miRNAS exosomales:

• No todos los miRNA son transportados por exosomas.
• Algunos miRNA solo han sido detectados en exosomas en estados patológicos.
• Se han detectado diferencias en los niveles de secreción de exosomas con miRNA, además de una diferente concentración de estos en su interior, tanto entre estado fisiológico normal y estado patológico, como en la evolución de la enfermedad.

Ante estos resultados, el departamento de Hematología/Oncología del Hospital Pediátrico Bambino Gesù ha propuesto el análisis de los miRNA exosomales mediante RT-qPCR para la detección del cáncer infantil y un mejor seguimiento del progreso de la enfermedad, además de su reacción a los diferentes tratamientos.

MiRNA como terapia

Debido a sus patrones de expresión y su habilidad de unirse a varias dianas, usualmente en un mismo proceso biológico, los miRNA pueden potencialmente regular la expresión de múltiples elementos en rutas de señalización conocidas por estar afectadas en determinados estados patológicos. 

Sin embargo, la baja especificidad de unión, aumenta el peligro de efectos secundarios importantes producto de la afectación de otras rutas fuera de la diana deseada.

Es indispensable así el desarrollo de herramientas que permitan una predicción más exacta de la unión miRNA – mRNA, validando su uso terapéutico.

MiRNA “mimics” y “AntagomiRs”

Distintas patologías se caracterizan por alteraciones en la expresión de miRNA; tanto sobreexpresión como infraexpresión. Es por ello que las terapias basadas en miRNA, buscan principalmente aumentar o reducir los niveles de un miRNA especifico, según sea el caso.

Infraexpresión de miRNA;

Para aumentar los niveles de un miRNA especifico, se utilizan “mimics” de miRNA. Son moléculas sintéticas de RNA que presentan la misma secuencia que el miRNA endógeno, pudiendo restablecer así los niveles y función normal de este.

También se utilizan “Short hairpin RNAs (shRNAs)”; moléculas sintéticas que son procesadas de forma endógena para dar miRNAs maduros. Los shRNAs han mostrado minimizar la toxicidad y permiten sintetizar varios miRNAs a partir de un solo promotor.

En cáncer, la mayoría de miRNAs se encuentran infraexpresados, muchos de estos regulan el ciclo celular y se consideran supresores de tumores, por lo que restablecer sus niveles puede complementar o potenciar la eficacia de otros tratamientos oncológicos.

Sobreexpresión de miRNA;

Para inhibir la función de un miRNA que se encuentra sobreexpresado, se utilizan “AntagomiRs”; moléculas sintéticas que se unen al miRNA endógeno, bloqueándolo y regulando su expresión.

Otra forma de inhibir la expresión de miRNAs, es utilizando sitios de unión competitivos. Estos sitios de unión suelen ser “Antisense oligonucleotides (ASOs)”. Estos ASOs se modifican para aumentar su resistencia a la degradación por nucleasas, su unión a proteínas plasmáticas, su complementariedad con el miRNA diana y su habilidad para activar el sistema inmune innato. Lo que tiene como resultado que los miRNAs tendrán mayor afinidad por estos ASOs sintéticos que por sus ARNm complementarios, viéndose inhibida su función.   

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