INTRODUCCIÓN

La triosa fosfato isomerasa (TPI) es una enzima fundamental para la glucolisis, al ser capaz de trasformar dihidroxiacetona e gliceraldehído-3-fosfato (DHAP y G3P, respectivamente) y viceversa (éste último es necesario para la siguiente reacción del proceso.). Permite una eficiencia mucho mayor en la glucolisis, y todavía no se ha observado ningún organismo que no la emplee. Si embargo, sí que existen patologías que pueden afectar a su rendimiento, dando lugar a enfermedades neurodegenerativas o anemias hemolíticas.

La TPI se considera una isomerasa, ya que convierte un isómero (compuesto con la misma fórmula molecular que otra molécula distinta) en otro. Esta, además, es una reacción reversible, cuyo equilibrio es determinado por la cantidad de cada uno de los isómeros e el medio.

ESTRUCTURA

Está compuesta por dos subunidades proteicas idénticas, lo que convierte esta proteína en un homodímero. Se trata de una proteína soluble, con cadenas de 27 kDa. Aunque sus dos dímeros funcionan independientemente el uno del otro, su emparejamiento es necesario para la estabilidad de la molécula. Su dimerización proporciona una muy alta resistencia a la oxidación y a la proteólisis.

Cada una de estas subunidades está compuesta por 8 láminas β paralelas unidas a sus adyacentes formando una circunferencia, pero también a una cadena α-hélice exterior. Esto crea una estructura llamada barril o tambor TIM (de hecho, TIM se refiere a la triosa fosfato isomerasa, ya que fue en esta enzima donde se vio por primera vez esta estructura). El barril TIM es la estructura más común y de las más conservadas en las proteínas. Se da únicamente en las proteínas de tipo α/β, ya que sólo estas tienen una mezcla de cadenas α y β no segregadas en la proteína. También es una proteína globular, como indica su forma.

Cada subunidad de la proteína está compuesta por 247 aminoácidos. Estas tienen su centro activo en el barril TIM, con un residuo de ácido glutámico (Glu 167) y una histidina (His 95, de los colores rojo y azul en la imagen). Estos dos componentes forman el enodiol, un intermediario en la reacción. Además, se forma un bucle entre los aminoácidos 166 y 176, que es capaz de unirse al grupo fosfato del sustrato mediante un puente de hidrógeno, estabilizando el intermedio y evitado su descomposición.

También hay una lisina con carga positiva cerca del centro activo, para contrarrestar la carga negativa del grupo fosfato. Esta distribución de cargas es muy importante: una TPI mutada puede conservar cierta funcionalidad si se mantiene la carga de la lisina.

PAPEL BIOLÓGICO Y MECANISMO DE FUNCIONAMIENTO

La triosa fosfato isomerasa realiza una de las 10 reacciones que conforman el proceso de la glucolisis, una de las principales fuentes de energía de la célula en forma de NADH y ATP y muy importante para la posterior fosforilación oxidativa. Es la última de las reacciones de la fase preparativa (las primeras 5), antes de la fase de generación de energía. Además, aparte de la glucólisis, es un interviniente fundamental en otros procesos, como la gluconeogénesis, la vía de las pentosas fosfato y la síntesis de ácidos grasos.

La reacción que cataliza es la isomerización de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) a gliceraldehído-3-fosfato (GADP) y viceversa. Ambas moléculas son productos de la catálisis de la fructosa 1,6-bisfosfato, la reacción inmediatamente anterior en la glucólisis. Sin embargo, sólo el GADP es útil para continuar la glucólisis. La isomerización de DHAP permite una mucha mayor eficiencia en la glucólisis, al posibilitar el aprovechamiento de esas moléculas.

La estructura de la enzima, ya explicada, es necesaria para su correcto funcionamiento. El ácido glutámico, cargado negativamente, adquiere un protón del carbono 2 del GADP, y la histidina transfiere protones para convertir la cetona del GADP en un grupo hidroxilo. Los grupos funcionales (la cetona y los grupos hidroxilo y fosfato) cambian de posición en la corta cadena. En eso consiste la reacción (en ambos sentidos, además, porque es una reacción reversible).

Para catalizar la reacción apropiadamente necesitan que su sitio activo y sus otras estructuras cercanas se mantengan, sin mutaciones ni errores en la transcripción. Otros errores en zonas menos cruciales para la proteína pueden aguantarse, mientras que no alteren la polaridad o la hidrofobicidad de la proteína

La TPI puede acelerar su reacción de isomerización por varias órdenes de magnitud. Aumenta tanto la velocidad de la reacción que esta se ve únicamente limitada por la frecuencia de los choques de sustrato y enzima (lo que la concede el poder llamarse un “catalizador perfecto”). Esto independiza su velocidad de las de otros pasos de catálisis.

Aunque esta reacción no esté sujeta a ningún tipo de moderación o regulación, ni esté asociada a ningún cofactor, no se debe subestimar su importancia. Sin ella, la glucólisis sería un proceso con una muy mermada eficiencia, poniendo problemas a la célula para obtener toda la energía que necesita.

PAPEL BIOMÉDICO

La TPI se transcribe a raíz de un solo gen, el TPI1, localizado en 12p13, el brazo corto del cromosoma 12. Su secuencia de aminoácidos ha sido observada en cientos de organismos, y en todos ellos esta enzima presenta parámetros similares. Sin embargo, este gen puede sufrir mutaciones que alteran su estructura e impiden su función.

La deficiencia genética de TPI en los humanos proviene de un gen recesivo autosómico. Si alguien es homocigoto respecto a este carácter (las personas heterocigotas no sufren esta patología), su TPI tendrá una fracción de la actividad que en una persona sana, desequilibrando las cantidades de DHAP y G3P (en favor de la primera). las personas que sufren esta enfermedad experimentan una anemia hemolítica y un trastorno neurodegenerativo como consecuencia y mueren prematuramente, antes de los 6 años. Es común sufrir también miopatías e infecciones a causa de esta mutación.

La patología afecta sobre todo al sistema nervioso y al circulatorio. Los más afectados son los glóbulos rojos, que acumulan demasiada DHAP, que en tales cantidades se vuelve tóxica y provoca la muerte de los eritrocitos. No tiene cura conocida, pero se puede aliviar mediante transfusiones de sangre. Se puede detectar durante la gestación.

Esta enfermedad se debe a una mutación que afecta al centro activo, cambiando el residuo de ácido glutámico por aspartato. El ácido glutámico está muy conservado en las TPI de todas las especies, haciendo testamento a su importancia. Al verse sustituido, convierte la TPI en una enzima termolábil, es decir, fácilmente inactivada por el calor. Hay otras mutaciones, una que cambia la glicina 122 por arginina y otra que cambia la fenilalanina 240 por leucina. Sin embargo, estas dos no causan patologías relevantes. La TPI no tiene mutaciones positivas, por lo que se considera una enzima “evolutivamente perfecta”

Por último, la triosa fosfato isomerasa también puede ser la clave para combatir uva de las enfermedades más mortíferas de nuestros días: la malaria. El Plasmodium falciparum, el protozoo parásito que causa esta enfermedad, sólo es capaz de producir ATP mediante la glucólisis. Por lo tanto, la TPI es de vital importancia para su supervivencia. Siguiendo este razonamiento, se está investigando la posibilidad de desarrollar un fármaco que pueda atacar específicamente a su triosa fosfato isomerasa. La dificultad radica en que, como la TPI es un estructura muy bien conservada en los seres vivos, hay muy pocas diferencias que permitan atacar únicamente al parásito y no crear una anemia hemolítica en la víctima, al perjudicar también a su propia TPI. El fármaco debe centrarse en las pocas diferencias entre ambas enzimas: los aminoácidos número 13 (metionina en humanos y cisteína en el parásito) y 96 (en vez de serina como los humanos, tendrá fenilalanina). Sin embargo, hay otro posible punto de ataque: la TPI del Plasmodium falciparum se asocia a la membrana celular con el aminoácido 183 (ácido glutámico en humanos, pero en el protozoo es una leucina completamente expuesta, lo que permita a la proteína asociarse a la membrana usando la fuerza hidrófoba).

REFERENCIAS

Torres, L. G. (Julio del 2007). CARACTERIZACIÓN DEL PATRÓN DE PLEGAMIENTO Y ASOCIACIÓN DE LA TRIOSAFOSFATO ISOMERASA DE HUMANO. Universidad Autónoma del estado de Hidalgo.

Sameer S Velanker, Soumya S Ray, Rajesh S Gokhale, Suma S, Hemalatha Balaram, P Balaram, MRN Murthy, Triosephosphate isomerase from Plasmodium falciparum:. the crystal structure provides insights into antimalarial drug design, Volume 5, Issue 6, 1997, Pages 751-761, ISSN 0969-2126

Wierenga, R. K. (2010, 7 agosto). Triosephosphate isomerase: a highly evolved biocatalyst. SpringerLink. https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-010-0473-9?error=cookies_not_supported&code=76c1c0ea-5a47-4388-bc99-f66a94e10431

Torres, L. G. (Julio del 2007). CARACTERIZACIÓN DEL PATRÓN DE PLEGAMIENTO Y ASOCIACIÓN DE LA TRIOSAFOSFATO ISOMERASA DE HUMANO. Universidad Autónoma del estado de Hidalgo.

Carl Branden and John Tooze. 1999. Introduction to Protein Structure 2nd ed. Garland Publishing: New York, NY. pp 47-50

Jordy Calderón, Oswaldo Carrera, Álex Granja, David Harb, Nathaly Mie. (s/f). Deficiencia de Triosa Fosfato Isomerasa (TPI). Universidad de las Américas.

Knowles JR (marzo de 1991). «Catálisis enzimática: no es diferente, solo mejor». Naturaleza . 350 (6314): 121–4. doi : 10.1038 / 350121a0 . PMID  2005961

Burton PM et al, The active centre of triose phosphate isomerase, Biochem J. 1966 September; 100(3): 702–710, su pubmedcentral.gov (archiviato dall’url originale l’8 maggio 2006).

Burton PM et al, Studies on the sub-units of triose phosphate isomerase, Biochem J. 1968 May; 107(6): 737–744, su pubmedcentral.gov (archiviato dall’url originale l’8 maggio 2006)

INTRODUCCIÓN

¿ES REALMENTE IMPORTANTE EL COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA?

Sabiendo que la producción principal de energía se lleva a cabo mediante el Ciclo de Krebs y que comienza con el componente acetil-coa, podemos deducir que el complejo piruvato deshidrogenasa es altamente necesario e indispensable para poder transformar piruvato en acetil-coa, siendo este, el metabolito intermediario. 

¿EN QUÉ PROCESOS Y DÓNDE APARECE?

Como ya hemos mencionado anteriormente es necesario para el funcionamiento del Ciclo de Krebs, actúa previamente en la preparación del acetil-coa, es decir, en la descarboxilación oxidativa del piruvato.

Este proceso convierte al piruvato, molécula de 3 carbonos en una molécula de 2, acetil-coa, unida a la coenzima a. Además de producir una molécula de NADH y otra de dióxido de carbono. Este proceso se lleva a cabo en eucariontes en la matriz mitocondrial, mientras que, en procariontes, se lleva a cabo en el citoplasma.

PAPEL BIOLÓGICO 

¿QUÉ NOS APORTA UNA PROTEÍNA?

Las proteínas son moléculas muy grandes y complejas que van a realizar funciones críticas de nuestro organismo, encargándose de la mayor parte del trabajo de las células. Es decir, son estrictamente imprescindibles para el correcto funcionamiento de nuestro cuerpo. 

En especial, en este caso, realizará una función principalmente enzimática, que se encargará prioritariamente de que se realicen las reacciones químicas en la célula y que se formen nuevas moléculas.

¿QUÉ APORTA EL PDH A NUESTRO ORGANISMO?

Es la forma en la que las células de nuestro cuerpo pueden recibir energía, siendo el piruvato el producto final de la glucólisis y la glucólisis el primer paso de la respiración celular. Por tanto, el PDH actúa como unión entre la glucólisis y el ciclo de Krebs. A partir de este punto, podemos deducir que el PDH es un componente crucial para la bioquímica, lo que implica que, si este no existiera o se presentará en una cantidad menor a la necesaria, se producirá una deficiencia de PDH (acidosis láctica) y por consiguiente de acetil-coa y como resultado final deficiencia de energía para las células de nuestro organismo.

ESTRUCTURA Y MECANISMO

¿QUIÉN LO FORMA?

PDH es un complejo que, formado por la repetición de 3 proteínas con diferentes actividades enzimáticas (E1,E2,E3) y otras estructurales y reguladoras, además de diferentes coenzimas.

¿QUÉ FUNCIÓN PRESENTA CADA COMPONENTE?

• La estructura E1 va a depender de pirofosfato de tiamina y se va a encargar de catalizar 2 etapas, la primera, la descarboxilación del piruvato que dará como resultado un componente intermedio (hidroxietil-tiamina-difosfato), y la segunda, la acetilación reductora del grupo lipoílo (unido a E2).
• Seguidamente la estructura E2 se va a encargar de catalizar la transferencia del grupo acetilo al CoA.
• Por último, la estructura E3 realizará la función de transferencia de electrones en dos fases, la primera a FAD y la segunda a NAD, para regenerar el lipoílo oxidado y pueda ser reciclado en próximos ciclos.

¿CÓMO SE LLEVA A CABO SU MECANISMO?

Reacción producida:

Pasos que se llevan a cabo:

¿DE QUÉ SE ENCARGAN LAS COENZIMAS EN ESTE PROCESO?

Sabemos que en este proceso participan 5 coenzimas mencionadas anteriormente, las cuales se clasifican según la función que desempeñan.

• Transporte de electrones, se encarga la coenzima FAD y NAD.
• Transporte de carbonos, en el cual participan la TPP y la coenzima A.
• Transporte mixto (electrones y carbonos), en el que solo encontramos el ácido lipoico.

¿CÓMO ACTÚAN?

Primeramente, el FAD es capaz de intercambiar electrones con versatilidad, es un transportador fijo, se asocia establemente a la enzima con la que trabaja. 

Su estado oxidado es FAD y reducido es FADH₂. 

En segundo lugar, el NAD es un transportador móvil, se va moviendo para recoger los electrones dispuestos en los centros activos de las enzimas. 

Su estado oxidado es NAD+ y reducido es NADH.

Seguidamente, el TPP, pirofosfato de tiamina, se encarga de unir los carbonos al suyo formando enlaces C-C, es un transportador fijo ya que está unido fuertemente a la enzima.

A continuación, la coenzima A es un transportador móvil de carbono que puede actuar tanto de dador como dador de los mismos.

Por último, el ácido lipoico es transportador fijo ya que está unido estrechamente a la enzima

BIOMEDICINA

¿QUÉ RELACIÓN PUEDE PRESENTAR CON LA BIOMEDICINA?

La formación de la enzima piruvato deshidrogenasa es un proceso completamente regulado. Por ello un cambio en las concentraciones por déficit o exceso ocasionan patologías metabólicas en el organismo

¿QUÉ PATOLOGÍAS ESTÁN RELACIONADAS CON EL PDH?

DÉFICIT DE PDH o ACIDOSIS LÁCTICA: como hemos dicho anteriormente, el PDH está relacionado con la obtención energética por vía aeróbica. La deficiencia del complejo provoca un bloqueo de esta vía, impidiendo así la transformación del piruvato en el metabolito intermediario. Por ende, no se inicia el ciclo de Krebs, disminuye la producción de energía y se produce la acumulación de lactato. 

Las patologías clínicas varían de gravedad, pero consisten en acidosis láctica y malformaciones del sistema nervioso central y otras alteraciones posnatales, como retraso intrauterino.

Además, se puede producir síndrome de Leigh (enfermedad neurodegenerativa progresiva hereditaria) y/o atrofia cerebral.

 La forma tardía se caracteriza por ataxia ( “signo neurológico que consiste en la falta de coordinación voluntaria de los movimientos musculares que puede incluir anomalías en la marcha, cambios en el habla y anomalías en los movimientos oculares”) o fatigabilidad y/o debilidad muscular.

Se ha demostrado correlación entre la edad y la concentración de PDH:  la actividad de la PDH mitocondrial  disminuye con la edad en el corazón, así como en ciertas regiones del cerebro (el cuerpo estriado y el tronco encefálico). Según un estudio de cardiología Marín-García, J. (2002, 1 diciembre). 

La mitocondria y el corazón | Revista Española de Cardiología. https://www.revespcardiol.org/es-la-mitocondria-el-corazon-articulo-13040595

Por ello, un diagnóstico y tratamiento precoces puede mejorar la calidad de vida de algunos pacientes.

AUMENTO SIGNIFICATIVO DE PDH, un aumento de la pdh promueve el envejecimiento, además puede causar senescencia celular inducida por oncogenes.

            REFERENCIAS

Attention Required! | Cloudflare. (s. f.). https://metabolicas.sjdhospitalbarcelona.org/ecm/deficiencia-piruvato-deshidrogenasa-pdh/info/funcion-tiene-pdh

Bank, R. P. D. (s. f.). RCSB PDB – 1EAA: ATOMIC STRUCTURE OF THE CUBIC CORE OF THE PYRUVATE DEHYDROGENASE MULTIENZYME COMPLEX. https://www.rcsb.org/structure/1eaa

Castaño, M. J. (2005, 1 febrero). Síndrome de Leigh con déficit de los complejos I, III y IV de la cadena respiratoria mitocondrial | Anales de Pediatría. https://www.analesdepediatria.org/es-sindrome-leigh-con-deficit-complejos-articulo-13071315

Complejo de la piruvato deshidrogenasa. (s. f.). https://biomodel.uah.es/metab/Krebs/PyrDH.htm

Database, A. P. S. (s. f.). AlphaFold Protein Structure Database. https://alphafold.com/entry/W1YPD9

Demczko, M. (2023, 1 febrero). Trastornos del metabolismo del piruvato. Manual MSD versión para profesionales. https://www.msdmanuals.com/es-es/professional/pediatr%C3%ADa/trastornos-hereditarios-del-metabolismo/trastornos-del-metabolismo-del-piruvato

La oxidación del piruvato (artículo). (s. f.). Khan Academy. https://es.khanacademy.org/science/biology/cellular-respiration-and-fermentation/pyruvate-oxidation-and-the-citric-acid-cycle/a/pyruvate-oxidation

Libretexts. (2022, 2 noviembre). 17.4: Reacción de difosfato de tiamina, lipoamida y piruvato deshidrogenasa. LibreTexts Español. https://espanol.libretexts.org/Quimica/Qu%C3%ADmica_Org%C3%A1nica/Qu%C3%ADmica_Org%C3%A1nica_con_%C3%89nfasis_Biol%C3%B3gico_(Soderberg)/17:_La_qu%C3%ADmica_org%C3%A1nica_de_las_vitaminas/17.04:_Reacci%C3%B3n_de_difosfato_de_tiamina,_lipoamida_y_piruvato_deshidrogenasa

Marín-García, J. (2002, 1 diciembre). La mitocondria y el corazón | Revista Española de Cardiología. https://www.revespcardiol.org/es-la-mitocondria-el-corazon-articulo-13040595

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PDB101: Molecule of the Month: Pyruvate Dehydrogenase Complex. (s. f.-c). RCSB: PDB-101. https://pdb101.rcsb.org/motm/153

Regulación de la respiración celular (artículo). (s. f.). Khan Academy. https://es.khanacademy.org/science/biology/cellular-respiration-and-fermentation/variations-on-cellular-respiration/a/regulation-of-cellular-respiration

Universidad CEU Cardenal Herrera. (2019, 5 junio). Proyecto Innovación: Complejo piruvato deshidrogenasa  Reacciones mas importantes del ciclo de krebs [Vídeo]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=peAQoeIb8GQ

User, S. (s. f.). Pruebas genéticas – Piruvato deshidrogenasa, Deficiencia de . . .; Deficiencia del complejo de piruvato-deshidrogenasa; Acidosis láctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa (Pyruvate dehydrogenase deficiency; pyruvate dehydrogenase complex deficiency. IVAMI. https://www.ivami.com/es/pruebas-geneticas-mutaciones-de-genes-humanos-enfermedades-neoplasias-y-farmacogenetica/1159-pruebas-geneticas-acidosis-lactica-por-deficiencia-de-piruvato-deshidrogenasa-deficiencia-de-piruvato-deshidrogenasa-gen-pdp1

Wikipedia contributors. (2023a, enero 17). Leigh syndrome. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Leigh_syndrome

Wikipedia contributors. (2023b, enero 29). Ataxia. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Ataxia

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Realizado por Lidia Gutiérrez Miguel y Sofía Gómez García.

Grado de Biología Sanitaria, Universidad de Alcalá de Henares.

Trabajo realizado por Silvia Rodríguez Masedo y Emma Peña Porras. 1º Biología Sanitaria.

PROTEÍNA RAS.

Índice.

1. Introducción.

2. Estructura

    2.1. Estructura primaria

    2.2. Estructuras secundaria y terciaria

3. Función y rutas principales.

4. Implicaciones biomédicas. Cáncer y rasopatías

5. Inhibidores y últimas investigaciones.

6. Referencias

1. Introducción

Los genes ras pertenecen a una superfamilia de genes que codifican pequeñas proteínas de unión a nucleótidos de guanina. Las proteínas RAS son una familia de enzimas con actividad GTPasa, altamente conservadas, que se localizan en la superficie interna de la membrana celular para poder llevar a cabo su función; actuar como centrales que reciben, modulan y transmiten las señales que controlan un gran número de procesos celulares como los de crecimiento, diferenciación, transformación y apoptosis, establecidos por las rutas de señalización en cascada que surgen de los receptores situados en la superficie celular.

La superfamilia de enzimas RAS consta de las subfamilias K-RAS, N-RAS y H-RAS, que codifican las cuatro isoformas de estas proteínas: H-, N-, K-Ras4A y K-Ras4B (las dos últimas, originadas por procesamiento alternativo del exón 4) y se expresan en todos los tejidos y tipos de células de forma distinta.

Estas proteínas tienen una importancia notoria en los procesos oncológicos, pues su función está estrechamente ligada al control de la proliferación celular.

2. Estructura

  2.1. Estructura primaria.

  La estructura primaria está conformada por una secuencia de residuos de aminoácidos unidos de forma covalente, conectados entre sí por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro, dando lugar al enlace peptídico.

La secuencia de las proteínas Ras contiene 189 aminoácidos, a singularidad de K-Ras4B que se forma por 188. En su estructura primaria se pueden distinguir 4 regiones diferentes. En primer lugar, la región contante comprende los primeros 85 aminoácidos comunes a las tres subfamilias (K-RAS, N-RAS y H-RAS). La región variable consta de los 80 aminoácidos siguientes, que continúan siendo altamente homólogas (80%). Tras esta, la región hipervariable compuesta por la región carboxilo terminal, en esta región apenas hay homología (4%). Los últimos cuatro aminoácidos (C cisteína, A aminoácido alifático y X metionina o serina) denominados “CAJA CAAX” fundan un dominio esencial para la unión a membranas y para la actividad de estas proteínas.

  2.2. Estructura secundaria y terciaria.

Vamos a estudiar la estructura de la proteína Ras analizando sus motivos de una forma comparativa, viendo la diferencia entre la proteína activa (unida a GTP) e inactiva (unida a GDP).

                                                                                                  

En las imágenes podemos reconocer:

5 hélices alfa representadas en amarillo, que se encuentran en la zona periférica de la proteína, aunque en la forma inactiva la hélice alfa que vemos en el centro de la proteína debido a la desviación de sus enlaces o interacciones, no es reconocida como tal en el programa de Ximera, si no que es reconocida como un bucle.

6 láminas beta, representadas en cian, que tienen una especie de estructura de tambor TIM abierto, que se encuentran en el centro de la estructura proteica. Tenemos 5 láminas paralelas y una en sentido contrario. Estas láminas se unen a las hélices alfa mediante bucles (en color carne)

Cofactor Mg 2+, representado en amarillo chillón, está interaccionando con la proteína a través de la serina 17 y también con el GDP, además, establece interacciones con moléculas de agua. Es en esta posición donde consigue realizar su función, favoreciendo la correcta alineación y la estabilización de RAS.                                               

En las imágenes superiores vemos mostrada la hidrofobicidad de la proteína RAS, lo que nos permite ver de una forma muy visual, el centro activo, también llamado bolsillo, que la proteína deja para la unión del GDP o GTP. Se ve como encaja este GDP o GTP (unidos al cofactor de magnesio) en el bolsillo con forma alargada que vemos ocupado en ambas imágenes.

Además, vemos como es más afín el GTP que el GDP, dado que en el GTP encaja perfectamente con el bolsillo mientras que el GDP encaja, pero deja un hueco, estableciendo por lo tanto menos interacciones y siendo esta unión menos estable.

 

En estas imágenes lo que vemos representado son los puentes de hidrógeno que se establecen entre el GTP/GDP y el centro activo. Sabemos que los puentes de hidrógeno estabilizan está unión, por lo tanto, a mayor número de interacciones por puentes de H, más afín será la unión, y por lo tanto más estable el complejo RAS- sustrato.

La unión de con GDP cuenta con 21 puentes de hidrógeno, mientras que la unión con GTP tiene 29, es decir, estos 8 puentes de hidrogeno adicionales hacen que la unión GTP- RAS, sea más estable, al igual que veíamos que era más estable en las imágenes de la hidrofobicidad. Es por ello por lo que esta unión al verse favorecida se puede descontrolar, desencadenando una cascada de señales descontrolada, que causan demasiada proliferación celular, favoreciendo la aparición de tumores.

3. Función y rutas principales.

Antes de explicar la cascada de señales que lleva a cabo la proteína Ras, recordamos las dos formas nos la podemos encontrar:

RAS-GTP: forma activada, donde la proteína RAS está unida a GTP

RAS-GDP: forma inactivada, donde la proteína RAS está unida a GDP

SEÑALIZACION CELULAR.

Consiste en la transmisión de información desde el exterior de la célula hasta su núcleo. Los factores de crecimiento llegan a los receptores de membrana, que interaccionan con proteínas adaptadoras (Shc, Grb2), y con los factores de intercambio de nucleótidos de Guanina (GEFs). Es en este momento cuando se produce la activación de Ras, mediante el paso de GDP a GTP.

En ausencia de señales de reproducción celular, entran en acción las proteínas GAP, que poseen actividad GTPasa, hidrolizando un grupo fosfato, inactivando a Ras. Estas proteínas GAP son imprescindibles dado que Ras presenta más afinidad por GTP que por GDP, y las proteínas GAP contrarrestan esa ventaja del GTP.

Las proteínas Ras, una vez activadas, pueden asociarse con varios efectores para ejercer sus efectos biológicos:

RAF: Es una proteína kinasa que tras su translocación se activa y activa mediante fosforilación a las quinasas MEK, que activan también mediante fosforilación a las proteínas Erk (conocidas como MAPKs), que activan factores de transcripción.

PI3K: Es una enzima que interviene en la producción de moléculas que actúan como segundos mensajeros, y está implicada en procesos como la organización del citoesqueleto o la división celular.

RalGDS: Es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina, que se conoce menos que las dos anteriores. Se sabe que están implicadas en la progresión del ciclo celular y en la transcripción de genes.

Ras también está estrechamente relacionada con la apoptosis.

• Induce apoptosis a través de la ruta RAF (Raf-Mek-Erk) y activando a p38.
• La función apoptótica depende de la subfamilia de Ras. En condiciones de estrés oxidativo, H-Ras V12 es apoptótica y K-Ras V12 será anti-apoptótica, sin embargo ante radiaciones ionizantes estas dos funciones se intercambian, siendo K-Ras V12 la apoptótica y H-Ras V12 será anti-apoptótica.
• Además, K-Ras tras ser fosforilado por PKC, se transloca a la mitocondria, donde se une a Bcl-XL (proteína inicialmente anti-apoptótica), convirtiéndolo en pro-apoptótico.

4. Implicaciones biomédicas. Cáncer y rasopatías.

-CÁNCER

El origen del cáncer tiene lugar debido a la formación de tumores  asociados a una mutación en una célula. De forma normal, esta mutación se corrige por la acción de determinados complejos enzimáticos de reparación o en caso de que no se repare con éxito se induce la apoptosis. Cuando ambos mecanismos fallan comienza a reproducirse la célula sin control, cada vez más rápido y resistentes al mecanismo de defensa de nuestro organismo. Cuando dicha célula (ahora tumoral) adquiere la capacidad de invadir tejidos (metástasis) produce cáncer.

Como hemos comentado previamente, la proteína ras está implicada en procesos como la proliferación celular, la diferenciación o apoptosis. Cuando esta sufre una mutación, pierde la capacidad de realizar correctamente muchas de las funciones mencionadas y no actúa correctamente ante factores de crecimiento o señales inhibidoras, adquiriendo capacidad de metástasis.

Desde hace más de 30 años se sabe que el 30% de los cánceres humanos presentan una mutación somática en alguno de los genes que codifican estas proteínas. La mutación de Ras que causa cáncer crea una forma de la proteína que siempre está activa. Esto es un desastre, porque el Ras mutado les dice continuamente a las células cancerosas que está bien que se multipliquen, sin los límites normales que controlan el crecimiento celular. Generalmente, sólo una de las isoformas está mutada en un tumor y la frecuencia en la que aparece mutada cada isoforma depende del tejido y tipo tumoral.

Diversos resultados de un estudio reciente, han determinado que los tumores en el colon izquierdo presentaban en un 62.7% de los pacientes que padecían esta enfermedad, una mutación presente en un 43.3% de las proteínas de tipo K-RAS, siendo el recto la localización más frecuente. El adenocarcinoma (un carcinoma es un tumor maligno del tejido epitelial) fue el tipo histológico más predominante en un 82%.  Las metástasis múltiples (el tumor maligno se expande a través de la sangre o sistema linfático y aparece en varios órganos) se observaron en el 58.6% de los tumores K-RAS mutados, siendo el hígado y pulmón los órganos más frecuentes. Como conclusión del estudio, determinaron que tumores K-RAS mutados se relacionaron con un mayor riesgo de esta enfermedad, incrementando la presencia de metástasis múltiples y por tanto un peor pronóstico. El valor predictivo del gen RAS frente a las terapias no pudo ser evaluado.

-RASOPATÍAS

Por otro lado, también se ha demostrado que las mutaciones en la línea germinal de RAS provocan anomalías en el desarrollo del individuo, aunque depende el gen afectado. Todos los pacientes comparten un grado variable de retraso mental o dificultades de aprendizaje, trastornos cardiacos, dismorfismo facial, anomalías cutáneas y en diversas situaciones predisposición al cáncer.

Entre estos síndromes, conocidos como rasopatías, se incluyen el síndrome de Noonan, el síndrome de Costello, la neurofibromatosis, el síndrome Leopard, el síndrome cardio-facio-cutáneo y el síndrome de Legius. Además, existen otras enfermedades relacionadas con mutaciones germinales en la vía RAS/MAPK que no afectan a procesos del desarrollo, pero si causan daños en las vías inmunológicas o a la formación de vasos sanguíneos. Predominan, el síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), el síndrome de malformaciones capilares y malformaciones arteriovenosas (CM-AVM) o la hiperplasia fibrosa gingival tipo 1 (HFG1).

Destacamos, como uno de los efectos principales, las manifestaciones cutáneas por estas rasopatías. A pesar de que el papel de la vía RAS/MAPK en el desarrollo del tegumento cutáneo no está del todo determinada, en un reciente estudio experimental se ha podido comprobar que la hiperactivación del KRAS bloquea la proliferación del pelo e induce la aparición de piel redundante (más larga y abundante de lo normal), crecimientos papilomatosos ( un papiloma es un tumor epitelial) y uñas cortas.

5. Ras como target farmacológico: Inhibidores y últimas investigaciones.

Investigaciones recientes, han encontrado ciertos compuestos químicos, que se encuentran todavía en estado de prueba, pero podrían ser posibles soluciones farmacológicas para la lucha contra el cáncer en un futuro no tan lejano. Entre ellos encontramos:

Benzimidina:

La presencia de anillos bencénicos en la benzimidina hace que sea posible la unión con el medio hidrofóbico otorgado por los aminoácidos del centro activo de RAS, haciendo la unión benzimidina-centro activo de RAS afín.

Esta molécula es capaz de unirse a un bolsillo de la proteína distinto al habitual, ocasionando la inhibición de la actividad de intercambio GTP/GDP vía proteínas SOS .Es decir, provoca un cambio conformacional que inactiva a la proteína, y esto impide que tenga lugar la proliferación celular; es por tanto una posible nueva estrategia en el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

N-{1-[N-(2,4-diclorofenil)glicil]piperidin-4-il}etinilsulfonamida:

Una de las vías más eficaces para inhabilitar o cambiar la conformación de una proteína es la unión a la misma de forma covalente.

El azufre de la cisteína del centro activo establece una interacción muy fuerte con el carbono de la etinilsulfonamida. Lo importante a reseñar sobre este ligando es que es selectivo, es decir, que solamente puede interaccionar con la cisteína que aparece en la proteína mutada, ausente en la nativa o inalterada. Esto representa un resultado muy prometedor porque significaría el balance entre alta eficacia y selectividad.

6.Bibliografía

• Introducción y estructura:

Sánchez, H. Á. (2016e, noviembre 29). Análisis y presentación de la estructura y función de una proteína. Estudio de la estructura y función de K-RAS. https://ebuah.uah.es/dspace/handle/10017/27238

Blanco, O. G. (2007). EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS p21 RAS y CÁNCER | Guirado Blanco | Medicentro Electrónica. https://medicentro.sld.cu/index.php/medicentro/article/view/733/748+https://docs.google.com/viewerng/viewer?url=https://digital.csic.es/bitstream/10261/89100/1/La+ruta+RAS-ERK.pdf

• Rutas:

La ruta RAS-ERK.pdf. (s. f.). https://docs.google.com/viewerng/viewer?url=https://digital.csic.es/bitstream/10261/89100/1/La+ruta+RAS-ERK.pdf

• Cáncer y rasopatías:

Blanco, O. G. (2007b). EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS p21 RAS y CÁNCER | Guirado Blanco | Medicentro Electrónica. https://medicentro.sld.cu/index.php/medicentro/article/view/733/748

Just a moment. . . (s. f.). https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000173101100113X?casa_token=voikaZe9Y4kAAAAA:SyW0Wdrtas0T4TcBYaPck7he460kR-0GgQgAHGMUxXOi90GhV1WqAxtWkRj7i9xLKok0T3lUqg

Sang, C. S. L. M. (2022a, noviembre 28). Determinación del gen ras como factor pronóstico y predictivo en cáncer colorrectal metastásico en el Instituto de Oncología Dr. Heriberto Pieter, enero 2019 – diciembre 2021. https://repositorio.unphu.edu.do/handle/123456789/4782

SciELO – Scientific Electronic Library Online. (s. f.). http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1022-51292003000300006

• Inhibidores:

 Sánchez, H. Á. (2016h, noviembre 29). Análisis y presentación de la estructura y función de una proteína. Estudio de la estructura y función de K-RAS. https://ebuah.uah.es/dspace/handle/10017/27238

Imágenes:

Imagen de las rutas por rasopatías:

Hernández-Martín, A., & Torrelo, A. (2011). Rasopatías: trastornos del desarrollo con predisposición al cáncer y manifestaciones cutáneas. Actas Dermo-Sifiliográficas, 102(6), 402-416.

Realizadas por nosotras desde Ximera o extraídas de las webs citadas anteriormente, y citadas en la leyenda de las correspondientes imágenes.

Por Giorgia Gallinato Raffaele, Biología sanitaria, UAH

Los deportistas están constantemente sometidos a una alta exigencia de trabajo fruto de las elevadas cargas de entrenamiento y todo lo que conlleva una competición. Por ello, la valoración de biomarcadores, la valoración bioquímica del estado nutricional y de diferentes parámetros como el lactato, la ferritina, la creatina kinasa, hemoglobina o el ratio cortisol-testosterona; son esenciales para mantener el control y mejorar el rendimiento del deportista.

En este post vamos a hablar sobre uno de estos biomarcadores, en concreto, sobre el lactato y la encima que lleva a cabo su producción, la lactato deshidrogenasa (LDH). Explicaremos como este ha pasado a ser este nuestro aliado en el entrenamiento, oponiendo las ideas que se tenían sobre dicho anión.

No ha sido hasta realizarse estudios en la última década, que se mantenía la idea de que el lactato jugaba un papel de “creador de la fatiga” ante el ejercicio de elevada intensidad y la insuficiencia de oxígeno (anaerobiosis). Muy lejos de ello, ahora sabemos que son varias las funciones que se adscriben a la aparición de altas concentraciones de lactato en el espacio extracelular. Además de jugar un papel energético, el lactato mejora la actividad muscular durante ejercicios intensos y duraderos. Y también, se reconocen múltiples acciones específicas del lactato a nivel celular: favorece el mantenimiento de su excitabilidad; interviene en la conductancia del canal de potasio dependiente de ATP; es un metabolito necesario en el sostenimiento de la glucólisis; tiene un efecto parcial como tamponador de radicales ácidos; y es un cebador en la fosforilación oxidativa en la mitocondria. Por otro lado, actúa sobre la síntesis de colágeno ayudando a la cicatrización de las heridas y como protector de lesiones cerebrales post-isquémicas transitorias. Estas funciones fisiológicas atribuyen un apreciado papel al lactato, otorgándole un protagonismo especial en el metabolismo intermediario de los diferentes tejidos, en la señalización entre células y en la misma célula.

No pretendo extenderme mucho en los aspectos puramente bioquímicos, pero para entender lo relevante que es este anión, producto final del metabolismo de la glucosa, para los deportistas y sus entrenadores; tenemos que hablar primero un poco de como se forma el ácido láctico y de la enzima encargada de su metabolismo, la ya mencionada LDH.

Entonces, ¿cómo llega el lactato a nuestras fibras musculares?

El lactato se produce debido a una falta de oxígeno durante la contracción muscular. Cuando realizamos ejercicio nuestro cuerpo utiliza energía proveniente de lo que llamamos metabolismo aeróbico, (proceso en el cual se usa el oxígeno para producir energía a partir de glucosa en sangre, a través de la fosforilación oxidativa) suficiente para caminar o subir unas escaleras. Sin embargo, esta forma de producir energía es muy lenta y cuando la intensidad del ejercicio sube a niveles de exigencia altos, es insuficiente, así pues necesitamos de otra fuente de energía para cubrir la demanda. Se activa entonces la vía metabólica anaeróbica, cuyo principal sustrato es el glucógeno intramuscular, que se encuentra dentro de las fibras y sufre una serie de reacciones, glucólisis anaerobia, obteniendo como productos 2 moléculas de ATP y ácido láctico. Esto ocurre principalmente en las fibras musculares de tipo IIb, que son las de contracción más rápida, la ventaja de esta respiración, porque a pesar de que es poco eficiente (obtenemos un máximo de 3 ATP, frente a los hasta 39 ATP que se pueden obtener en la fosforilación oxidativa), nos proporciona de forma inmediata la energía que nos falta a cambio de la acumulación de lactato en sangre. Aunque cabe apuntarse que estos términos de respiración anaerobia y aerobia se encuentran puestos en duda actualmente, pero esto no viene al caso.

Sin embargo, este mecanismo de obtención de energía no se puede mantenerse durante un periodo prolongado, ya que tan solo en 15 minutos de ejercicio muy intenso puede agotarse del 60% al 70% del glucógeno almacenado en los músculos. El agotamiento total puede producirse después de 90 minutos de ejercicio intenso. Y es que se necesitan entre 24 y 48 horas para reponer las reservas del mismo.

Bien es cierto es que el efecto que produce la acumulación de lactato es algo desagradable, se experimenta una sintomatología temporal de sensación de hormigueo en las piernas, falta de fuerza y sobre todo ganas de vomitar; producida por la presencia excesiva de ácido láctico en el torrente sanguíneo, experimentando acidosis láctica. Pero a pesar de presentar esta sintomatología no es el lactato el culpable de nuestra fatiga, si no que no es más que un aviso de nuestro organismo que nos está diciendo que ya ha llegado a su máximo esfuerzo y está sufriendo una alta fatiga.

¿Y que es ese “ácido láctico” que hemos nombrado ya varias veces y nos provoca esta sintomatología que llevó a pensar que el lactato era responsable de nuestra fatiga?

De nuevo trataré de ser breve con la explicación bioquímica.

El ácido l-láctico (enantiómero funcional biológicamente), se produce a partir del ácido pirúvico a través de la LDH en el proceso de fermentación. El lactato se produce continuamente en el metabolismo; la concentración de lactato en sangre usualmente es inferior a 2 mmol/l en reposo, pudiendo aumentar hasta 12 mmol/l ante un ejercicio de alta intensidad. Este incremento de lactato no tiene lugar hasta que el índice de producción no supera al de eliminación, influyendo en ello varios factores como transportadores monocarboxilatos, concentración de enzima y la capacidad oxidativa de los tejidos.

Vamos a explicar que quiere decir esto exactamente. En el estado de reposo, a pH fisiológico, en el cuerpo humano 7’35, el lactato se encuentra únicamente en su forma disociada, es decir como lactato y no como ácido. Cuando como hemos venido diciendo hasta ahora la demanda energética, de nuestras fibras musculares en especial, sobrepasa las disponibilidad de oxígeno en sangre para seguir llevando a cabo la respiración aerobia, bajo estas condiciones, la piruvato deshidrogenasa no alcanza a convertir el piruvato a acetil-coA lo suficientemente rápido y el piruvato comienza a acumularse. Esto generalmente inhibiría la glucólisis y reduciría la producción de ATP, para que esto no ocurra la LDH comienza a jugar su papel. La LDH reduce el piruvato a lactato oxidando el NADH+, obteniéndose como producto NAD+ que es necesario en la glucolisis para así seguir generando ATP. El lactato producido sale de la célula muscular y circula por la sangre. La situación ante la que nos encontramos ahora en la sangre es una variación del PH. En concreto una disminución, en más de un cuadro de 0’2 (acidificación del ph), a su vez la presencia de CO2 en sangre se eleva y por tanto el nivel de bicarbonato es bajo. Llegamos a la situación que veníamos tratando de explicar, nos encontramos ante la acidosis láctica del metabolismo.

Posteriormente este lactato producido sale de la célula muscular y circula por el torrente sanguíneo hasta el hígado, donde se vuelve a transformar en glucosa por gluconeogénesis. Al ciclo que comprende la glicólisis en la célula muscular y su reciclaje por gluconeogénesis en el hígado se le conoce como ciclo de Cori, que lo dejaremos para otro momento, porque ya estamos cerca de comprender lo que este post trata de explicar.

Ahora que ya conocemos que es el lactato y como se produce, podemos explicar por qué este es nuestro aliado en el entrenamiento.

Hemos comprendido que cuando nos encontramos ante la acidosis láctica, estamos en la situación en la que nuestro cuerpo por un ejercicio intenso se encuentra en su punto de máximo esfuerzo. Para entrenadores y deportistas la clave está en preparar un entrenamiento que haga posible que alcancemos nuestro umbral de lactato en el punto más elevado posible, lo que nos ayudará a mantener una intensidad alta de ejercicio sin acumular lactato, manteniendo por un periodo más prolongado el rendimiento. Es decir, con esta técnica de entrenamiento, conseguiremos que a la hora de la competición podamos esforzar aún más nuestro organismo, porque acostumbrado a trabajar a muy altas intensidades y regulada la producción de lactato en el entrenamiento, seremos capaces de rendir a una intensidad muy alta sin que nuestro cuerpo acumule el lactato, así rindiendo durante más tiempo a una mayor intensidad.

A pesar de que se habla de trabajar con el umbral de lactato como una “modalidad de entrenamiento”, este difiere mucho dependiendo del deporte que practiquemos e incluso dentro de los diferentes deportes, de la modalidad. Pues, por ejemplo, un corredor de maratón y un corredor de 100 metros requieren alcanzar y mantener el umbral de lactato durante periodos de tiempo diferentes. En el primer caso nos interesa mantener el lactato en un nivel lo más bajo posible dentro de su máximo ya que aunque lo entrenemos inevitablemente durante la competición lo vamos a alcanzar, durante un periodo de tiempo prolongado; sin embargo, en el segundo caso, no se requiere del mantenimiento de lactato en sangre constante durante un periodo de tiempo, si no mantener el nivel de lactato lo más bajo posible durante el breve tiempo del esfuerzo para poder actuar con la máxima potencia e intensidad. Bien es cierto que el control del lactato y los resultados son más notables en las pruebas prolongadas, pero este método de entrenamiento será efectivo en todas las disciplinas. Por eso reincido en la idea de que cada entrenamiento ha de ser pautado por un preparador físico, y específico para cada deportista.  

Pongamos para finalizar, un ejemplo concreto de prueba de lactato en un entrenamiento para waterpolistas.

El waterpolo es un deporte colectivo y en el que se pueden realizar cambios sin límite de número a lo largo del partido, pero eso no implica que a los deportistas no les interese regular sus niveles de lactato, todo lo contrario, ya que los partidos son largo y muy exigentes, así durante el tiempo de juego serán más intensos, además tendrán una mayor facilidad de recuperación cuando les toque descanso.

El test se puede realizar durante el juego, pero esto es algo complejo, porque en cada partido ocurren diferentes situaciones y no todos los partidos tienen las mismas exigencias; así que la mejor opción para los waterpolistas es realizar una prueba de natación, sin lugar a duda algo muy importante en este deporte.

Habitualmente se realizan test de entorno unas 4-6 series de 50, 100 o 200 metros (series de corta-media distancia) que se tratarán de hacer todas a la máxima velocidad y entre cada serie se descansará lo mismo. Lo que tratamos de buscar, la base del entrenamiento, es que el deportista realice todas la series aproximadamente en el mismo tiempo y que este sea cercano a su mejor marca en la prueba. Lo que ocurrirá, es que a medida que pasen las series, los niveles de lactato aumentarán, a pesar de que haya descanso entre series porque no será un descanso completo, ante la fatiga generada y acumulada en el organismo, nuestras fibras musculares requerirán cada vez de una mayor y más rápida producción de ATP, que desencadenará la acumulación de lactato en sangre, cada vez las series se realizarán más lento, los niveles de lactato en las últimas series serán mucho más altos que en las primeras.

Para la medición de lactato, realizaremos un pequeño pinchazo en el lóbulo de la oreja (se puede realizar en el dedo, pero en el caso de los nadadores lo realizaremos en la oreja por comodidad, será más fácil mantener la oreja seca durante el pinchazo), tomaremos la pequeña muestra de sangre y un aparato medidor de lactato nos proporcionará la cantidad de lactato que hay en sangre. Es importante realizar la medición antes de comenzar la prueba, entre series y pasado un periodo de descanso al finalizar para también controlar la recuperación.

Estudios realizados, aunque son breves los datos disponibles sobre waterpolistas, certifican que como ocurre en las últimas series del test, en el último cuarto de los partidos, los niveles de lactato son más elevados. También se observa que en los equipos de mayor nivel es considerable la ralentización de la subida exponencial de lactado en sangre a lo largo de la prueba y partidos, gracias a su mejor ritmo de partido, gracias a su mejor condición aeróbica. Como podemos observar en la siguiente tabla obtenida del artículo: “ANÁLISIS DE LOS FACTORES DE RENDIMIENTO EN WATERPOLO MASCULINO ÉLITE” de Gómez-García, J., Cejuela, R., Sellés, S.

Anotados los datos, el tiempo de cada serie y el nivel del lactato, podremos preparar entrenamientos de manera precisa, esto ya es trabajo de entrenadores y preparadores físicos, que nos hagan mejorar estos parámetros de cara al próximo test, pero sobre todo a la competición. Ayudándonos a mantener nuestro rendimiento a un mayor nivel de intensidad, durante un mayor periodo de tiempo y al contrario de lo que se creía, reduciendo nuestra fatiga gracias a la mejora en nuestra velocidad de recuperación, gracias a la ralentización en la producción y mejor tolerancia del lactato, nuestro aliado en el entrenamiento.

Referencias

Ribas, J. (2010). Lactato: De indeseable a valioso metabolito. El papel de la producción de lactato en la regulación de la excitabilidad durante altas demandas de potencia en las fibras musculares. Arch. med. deporte, 211-230.

Gómez-García, J., Cejuela, R. y Sellés, S. (2020). Análisis de los factores de rendimiento en waterpolo masculino élite. Trances, 12(2):49-78.

Peinado Lozano, A. B., Barriopedro Moro, M. I., Benito Peinado, P. J., & Calderon Montero, F. J. (2017). Do the changes in acid-base status and respiratory gas exchange explain the voluntary termination of a test performed above the maximum lactate steady state?=¿ Pueden los cambios del estado ácido-base e intercambio de gases respiratorios explicar el abandono de una prueba realizada por encima del máximo estado estable de lactato?. Archivos de Medicina del Deporte, 34(178), 80-85.

Cupitre Alejo, J. E., & Olarte Ortiz, B. F. (2022). LACTOSOFT-Un software aplicado al test estándar del lactato de la UDEC Extensión Soacha.

C. Menor-Salván. Ver. 2.5. Abril 2023

El descubrimiento de la estructura del ADN fue uno de los logros científicos destacados del siglo XX. En él participaron además de los conocidos Watson y Crick y Rosalind Franklin, una serie de científicos relevantes, cuyo nombre apenas se recuerda; sin sus contribuciones, no podemos entender la historia completa. Esta aventura nos enseña además que, en la ciencia, aunque se hagan famosos los «goleadores», el conocimiento se construye de modo colectivo y los errores pueden ser tan importantes como los aciertos. Delicioso es el fruto que surge tras el amargor del error y la ignorancia, y de ellos es desde donde se construye la ciencia. Además, los aspectos mundanos pueden ser tan relevantes como los técnicos.

El ADN se descubrió en el siglo XIX, pero se tardó más de medio siglo en revelar su estructura

No hay que confundir el descubrimiento de la estructura del ADN, con el descubrimiento del ADN en sí. Se atribuye el descubrimiento del ADN al químico suizo Friedrich Miescher, entre 1860 y 1874, siendo Phoebus Levene quien dio, en 1909, su descripción química precisa. Miescher propuso, en 1874, que, de alguna manera la «nucleína» (nombre que dió al ADN) era la «causa específica de la fertilización».

Levene acuñó el término ‘ácido nucleico’. Propuso la ‘teoría del tetranucleótido’, sugiriendo que el ADN estaba compuesto por cuatro bases, un azúcar y fosfato. Sin embargo, en aquel momento, aún no existía la tecnología necesaria para entender la arquitectura de la molécula.

Pasó casi medio siglo hasta que se determinó su estructura, lo cual era un problema muy complicado, tanto tecnológicamente como por la dificultad para obtener datos de la molécula. Y no había nadie mejor para lograrlo que el genial químico estadounidense Linus Pauling (1901-1994), quien estuvo a las puertas de conseguirlo antes de que Watson, Crick, Wilkins y Franklin publicaran su famoso artículo triple de abril de 1953.

Pauling fue uno de los científicos más relevantes del siglo XX. Recibió el premio Nobel en Química en 1954 por su contribución al conocimiento de los enlaces químicos. Para esa fecha había realizado tantos descubrimientos importantes en numerosos campos de la Química y la Biología, que, cuando le llamaron para comunicarle la concesión del premio, pidió a su interlocutor que le leyese la comunicación, pues no tenía claro por cuál de sus trabajos recibía el premio.

Pauling había resuelto otro gran problema: la estructura de las proteínas. Con Robert Corey y Herman Branson, publicaron en 1951 las estructuras secundarias que ahora ilustran los libros de texto. Este importante trabajo era ya suficiente para que tuviera fama imperecedera en el mundo de la Ciencia, pero Pauling era ambicioso y estaba obsesionado con resolver todas las estructuras de macromoléculas biológicas. Así, era el favorito en la carrera por el ADN. Él mismo estaba convencido de ello.

Astbury, Bell y la triple hélice de Pauling

Una brillante química británica, Florence Bell, presentó, en 1939, su tesis sobre la estructura del ADN y las proteínas, bajo la dirección de William Astbury. En ella, Bell y Astbury presentaron, por primera vez en la Historia, imágenes de difracción de rayos X de ADN. Esta compleja técnica, que se utiliza desde la Bioquímica Estructural hasta la Mineralogía, es esencial para resolver las estructuras macromoleculares así como las estructuras de los sólidos cristalinos. Y ahí está el problema: EL ADN es muy difícil de cristalizar y tiene una peculiaridad clave que descubrió Rosalind Franklin: puede cambiar de forma.

Bell dio un esbozo de la estructura del ADN, formado por largas fibras con las bases colocadas en paralelo y unidas, a modo de cuentas de collar, por el fosfato, pero no pudo avanzar más. Su tesis relata los intentos para obtener una muestra de ADN lo suficientemente cristalina, que terminaban en imágenes de difracción borrosas. El ADN se resistía a revelar su estructura. Había algo que Bell ignoraba: el ADN no tiene una única forma. Al preparar el ADN puro, se formaba una mezcla de lo que ahora conocemos como ADN B y ADN A, que hacían muy difícil interpretar los datos.

Fue Rosalind Franklin, 15 años después, quien logró lo que Bell no pudo: obtener una forma única de ADN cristalino, en su forma canónica ADN B, con el que hizo posible la famosa foto 51, que aclaró definitivamente la estructura.

Aun así, Bell proporcionó datos importantes, gracias a una imagen particularmente clara, la imagen 19, como la distancia entre las bases y que los nucleótidos formaban largas cadenas.

Pauling estudió los resultados de Bell y Astbury, tomando como hipótesis que las bases del ADN se orientan al exterior, para enlazarse con otras moléculas y que los fosfatos se organizan en un patrón similar al de algunos minerales. También tuvo en cuenta otro dato fundamental: el biofísico Robley Williams había logrado, en 1952, obtener una imagen en 3D de una molécula de ADN con un microscopio electrónico. Pauling observó que ese pequeño cilindro podría ser una trenza helicoidal.

Con estas ideas, propuso un modelo en triple hélice, en un artículo enviado, no sin prisas, el 31 de diciembre de 1952. En él, publicado en febrero de 1953, Pauling sugiere que su modelo es todavía algo preliminar y requería refinado. Su colaborador Corey le avisó de que había problemas, como que el modelo no encajaba del todo bien, no se podían incluir iones de sodio, a pesar de que el ADN formaba una sal sódica, y estaba el problema de la repulsión de las cargas del fosfato; Pauling reconoció que su modelo estaba algo «apretado». Pero la prisa estaba justificada: sabía que, en Gran Bretaña, Maurice Wilkins y su equipo estaban obteniendo imágenes de difracción del ADN y que unos entonces desconocidos James Watson y Francis Crick estaban trabajando en un modelo de ADN.

Sin embargo, el modelo de Pauling resultó ser erróneo.

Pares de bases y la precaución de Wilkins

El modelo en triple hélice encajaba mas o menos bien con los datos de difracción de rayos X de los que disponía Pauling. Es más, el primer modelo de ADN que idearon Watson y Crick, en 1951, era una triple hélice similar a la de Pauling. La diferencia es que ellos contaron con Rosalind Franklin. Cuando mostraron a Franklin su modelo, ella les dio razones convincentes por las que el modelo no era válido. Franklin ya había observado la importancia del agua y de los iones en la estructura (ella estaba trabajando con la sal sódica del ADN) y de cómo debían distribuirse los fosfatos. Ellos la escucharon y volvieron a los cálculos de un nuevo modelo. En ese momento, Franklin y Wilkins, aunque no estaban a favor de determinar un modelo aún, también pensaban que se trataba de una triple hélice. Tendría que llegar la foto 51, obtenida por Franklin, a despejar las dudas: la molécula de ADN era una doble hélice.

Las claves científicas del error de la triple hélice de Pauling las explica Rosalind Franklin en su magnífico artículo de 1953, en el que muestra que tenía clara la estructura: los datos de Pauling no eran lo suficientemente resolutivos; además, una hélice con los fosfatos en el interior y las bases en el exterior no encaja, ni con las propiedades del ADN, ni con la química del fosfato; y, no menos importante, Pauling no tuvo en cuenta un hallazgo previo fundamental al que Franklin si da crédito.

En 1947, un joven bioquímico, Michael Creeth, propuso un modelo de ADN formado por dos cadenas unidas por puentes de hidrógeno entre sus bases. Los mentores de Creeth eran Gulland y Jordan, quienes habían demostrado el apareamiento entre bases del ADN. Esta observación, para Franklin, tal como ella misma cuenta en su artículo de 1953, es fundamental. Considerando los pares de bases y los datos de difracción, la famosa doble hélice emergía como la estructura correcta.

Consciente de que los datos de Bell y Astbury no tenían resolución suficiente, Pauling escribió a Wilkins, solicitando ver los suyos. Wilkins, que no deseaba que el gran Pauling tomara el control de la investigación, se negó. Suele decirse que Pauling no tuvo oportunidad de reunirse con ellos directamente, debido a que el gobierno de EEUU le denegó la renovación del pasaporte para viajar a Gran Bretaña en 1951. Lo cierto es que el impacto de esta anécdota no fue grande, pues, finalmente, Pauling visitó Inglaterra durante un mes en 1952, coincidiendo con el trabajo clave de Franklin y, durante el cual, lamentablemente, no prestó atención al ADN.

Mientras Pauling, pensando que Wilkins seguiría negándose a colaborar, se centraba en sus trabajos con las proteínas, Franklin y su doctorando Gosling obtenían las imágenes históricas que confirmaron la estructura del ADN. Franklin no tenía inconvenientes para mostrar sus resultados y, si Pauling hubiera hablado con ella directamente, la historia del ADN sería distinta. Es más, ocurrió algo extraño: Franklin mostró sus imágenes a Corey, mano derecha de Pauling. Corey sugirió a Pauling que el modelo de triple hélice no encajaba bien y que había varios problemas. Pero él insistió, pensando que, bueno, ya resolverían los problemas pendientes. No visitar a Franklin y no escuchar a Corey fue un error histórico.

No fue el único error de Pauling. Watson y Crick tuvieron en cuenta otro dato clave: el bioquímico austriaco Erwin Chargaff les explicó que las bases del ADN siguen una proporción muy sencilla, que hoy conocemos como reglas de Chargaff. Estas apoyaban la idea de que las dos cadenas estarían unidas por las bases. Pauling y Chargaff se conocieron en 1947 durante un crucero de vuelta a EEUU y hablaron de ello; pero, considerándole un tipo «molesto y desagradable», Pauling despreció sus observaciones.

El modelo erróneo de Pauling fue el impulso definitivo que llevó a Watson y Crick a publicar, sólo dos meses después, su doble hélice. Cuando el artículo de Pauling apareció en febrero de 1953, los británicos estaban sorprendidos: era un modelo ingenuo, erróneo, similar al que ellos concibieron en 1951 y que Franklin les hizo desechar, y que, como los mismos Watson y Crick comentaron, incluso violaba las reglas químicas básicas del fosfato, expuestas por el propio Pauling en su famoso libro de texto de Química General. Eufóricos por la oportunidad que el error de Pauling les brindaba, era el momento perfecto para arrebatarle la gloria de resolver la estructura del ADN; se apresuraron, entonces, a publicar su modelo antes de que Pauling tuviera tiempo de darse cuenta de su fallo y rehacer su modelo, a la vista de los nuevos datos de difracción de rayos X.

Así, en abril de 1953, tras un acuerdo con Wilkins y Franklin, se publicaron tres artículos: uno por Watson y Crick, otro por Wilkins y el tercero por Franklin y Gosling, detallando la estructura del ADN y los datos esenciales que la sostienen. Sorprende que mucha gente piense que aquel mes se publicó un sólo artículo, firmado por Watson, Crick y Wilkins, y que Franklin fue ignorada completamente. Como ocurre con El Quijote, que todo el mundo lo conoce, pero casi nadie lo ha leído. Sin embargo, la lectura de los artículos aclara cosas, como que, en efecto, no fue un artículo, sino tres, cada uno preparado por los líderes del descubrimiento: Watson y Crick eran los teóricos que desarrollaron el modelo, y Wilkins y Franklin los experimentalistas que lograron preparar el ADN puro y obtener los datos de su estructura. A priori no parece mal arreglo. Con ojos actuales, cada uno de ellos tendría su paper histórico en Nature como IP (Los problemas de índole personal que llevaron a que Wilkins y Franklin publicaran por separado, o por qué publicaron tres papers separados en lugar de uno todos juntos, no son objeto de esta entrada, y es un tema que se discute mucho, aunque para mi forma parte del gossip científico, no de la ciencia en sí)

Aceptando la derrota

Pauling aceptó sus errores con elegancia y, en la Conferencia Solvay de ese mismo abril de 1953, expresó su apoyo al modelo de Watson y Crick:

«Aunque solo han pasado dos meses desde que el profesor Corey y yo publicamos nuestra estructura propuesta para el ácido nucleico, debemos admitir que probablemente esté equivocada; Aunque se podría hacer algo de refinamiento, creo que es muy probable que la estructura de Watson-Crick sea esencialmente correcta»

En 1988, durante una conversación informal en un congreso, Pauling recapitulaba:

«Supongo que siempre pensé que la estructura del ADN era mía para resolver y, por lo tanto, no la perseguí con suficiente agresividad».

Definitivamente, no escuchar las señales de que su modelo no era correcto y su ambición, que le llevó a estar convencido de que era el único que podría resolverla, no le ayudaron.

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Anexo 1: Cómo ayudó la foto 51 a revelar la estructura

La técnica de difracción de rayos X (DRX) es y ha sido esencial para la Biología. Es una técnica compleja, costosa y que requiere de una larga formación específica, por lo que los cristalógrafos, como lo fueron Rosalind Franklin, Florence Bell o el propio Pauling, expertos en DRX, son muy valiosos para la investigación y su labor no siempre es suficientemente reconocida. Prácticamente todas las estructuras que podemos encontrar en el Protein Data Bank, por ejemplo, han sido resueltas mediante DRX.

Para obtener un buen patrón de difracción, o difractograma, es necesario disponer de una muestra muy pura del compuesto que se está analizando, uniforme y cristalina (es decir, todas las moléculas de la muestra están ordenadas). Esto fue muy difícil de conseguir con el ADN, en especial por su tendencia a la transición entre ADN A y ADN B según su contenido en agua.

Rosalind Franklin y Raymond Gosling (a quien nadie recuerda, a pesar de haber trabajado en el laboratorio codo con codo con Franklin) consiguieron una imagen excepcional, como hemos visto: la famosa foto 51. Esta foto se reproduce en muchas ocasiones, pero ¿qué significa? ¿cómo se interpreta?

La interpretación completa es muy compleja, pero podemos entenderla de modo sencillo, en especial si usamos un experimento: si tomamos un muelle de boli o cualquier otro muelle pequeño y fino y lo iluminamos con un láser, que tenga el haz cuanto más grueso mejor (de modo que ilumine varias vueltas de hélice al mismo tiempo), el muelle va a difractar la luz laser. Como la diferencia entre la distancia de vueltas del muelle y la longitud de onda del laser es muy alta, el patrón de difracción que se produce es la difracción de campo lejano o difracción de Fraunhofer, que podemos ver al proyectar la luz a una distancia de entre 2 y 6 metros del muelle. El patrón de difracción nos permite medir con mucha precisión las medidas del muelle. Si cambiamos el muelle por moléculas ordenadas de un compuesto, y el láser por un haz fino de rayos X, muy penetrante y de longitud de onda muy pequeña, comparable a las dimensiones de la molécula, obtendremos un patrón de difracción de su estructura.

El patrón de difracción de una estructura en hélice da lugar a una «X» muy característica. El ángulo de la «X» y la distancia entre las manchas luminosas nos permite calcular las medidas de la hélice. Si nos fijamos en las imágenes de Florence Bell, este patrón no está nada claro, debido a las dificultades que tuvo para preparar la muestra. Pauling supo que la molécula de ADN era helicoidal porque vio una imagen de microscopía electrónica.

Otro aspecto clave de la foto 51 es que revelaba claramente que el ADN no estaba formado por una hélice, sino por dos hélices unidas, con un desfase entre ellas. Este desfase daba lugar a los huecos que se pueden ver en la imagen. Este dato confirmaba definitivamente que el ADN estaba formado por dos hebras unidas formando una hélice doble. Franklin pudo medir la molécula usando el patrón, obteniendo un ajuste muy bueno con el modelo teórico propuesto por Watson y Crick.

¿Qué habría ocurrido si el modelo de Creeth hubiera sido correcto? El patrón de difracción habría sido completamente distinto. Podemos modelizarlo también mediante la difracción de Fraunhofer de dos alambres paralelos muy juntos:

Esto nos da un patrón de difracción o difractograma lineal:

Como en el caso anterior, con el espaciado entre las manchas luminosas podemos medir la distancia entre los dos alambres. Comparemos este difractograma con el difractograma de rayos X real de un poliester, un polímero lineal formado por cadenas paralelas:

Y aquí vemos el patrón de difracción de un fragmento proteico formado por láminas beta paralelas:

Así queda demostrada la estructura de la molécula usando un método físico clave, la DRX. La verdad es que las cosas son como tienen que ser: si el DNA tuviera la estructura de Creeth, la Biología Molecular sería imposible, y por tanto la vida. Pero eso todavía no lo sabían en los años 1940-1950.

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Anexo 2: Extracto de los artículos históricos de abril de 1953

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https://www.historyofinformation.com/detail.php?entryid=4425

AUTORES: LUCÍA ALAMÁN TARDÁGUILA Y MARÍA CELEMÍN FLOX

La malato deshidrogenasa es una enzima de la familia de las oxidorreductasas, por tanto cataliza la transferencia de electrones desde una molécula donante a otra aceptora.

El gen de malato deshidrogenasa está regulado para adaptarse a un crecimiento celular tanto anaeróbico como aeróbico dependiendo del sustrato de carbono al que se une. La expresión de está enzima ha variado varias veces a lo largo de la evolución dando lugar a diferentes isoenzimas que participan en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. 

Los organismos procariotas tienen una única forma de esta enzima mientras que los eucariotas presentan dos isoformas (una en el citoplasma y otra en la mitocondria, exactamente en la matriz mitocondrial). Además, en los vegetales encontramos una isoforma adicional de malato deshidrogenasa, que participará en procesos esenciales como la fotosíntesis C4, el ciclo de Calvin y procesos de absorción del CO2 atmosférico.

Las distintas funciones biológicas de esta enzima dependen de cada isoforma: la malato deshidrogenasa que se encuentra en la matriz mitocondrial o MDH2  participa en la vía del ácido cítrico, también llamada ciclo de Krebs en la conversión de oxalacetato a malato. Esta reacción es reversible por lo que también tiene lugar en el otro sentido, sin embargo en un sentido se lleva a cabo por la MDH2 (de malato a oxalacetato) y la reacción en el otro sentido se lleva a cabo por la MDH citoplásmica.

Además, para llevar a cabo esta transformación utiliza NAD+ como aceptor de electrones y participa en el transporte de electrones del citosol a la mitocondria a través de un sistema denominado lanzadera malato-aspartato.

Imagen creada por ChimeraX

En la estructura de la malato deshidrogenasa se puede observar una alternancia entre alfas hélice y láminas beta. Cada subunidad está formada por dos dominios estructurales y funcionalmente distintos: el primero está formado por láminas beta paralelas dispuestas formando un plegamiento de Rossmann, que a su vez constituye un dominio de unión a la molécula NAD; el segundo es un dominio carboxi-terminal en el que se encuentra el sitio de unión del sustrato.

Las distintas subunidades se encuentran unidas mediante las distintas fuerzas intermoleculares como puentes de hidrógeno y la interacción hidrófoba. Además, la malato deshidrogenasa sufre un cambio conformacional, de una conformación abierta a una cerrada mejorando la catálisis de malato deshidrogenasa ya que de esta manera se protege al sustrato. 

Foto creada por ChimeraX: estructura de la malato deshidrogenasa

FUNCIÓN DE LA MALATO DESHIDROGENASA CLOROPLASMÁTICA

La conversión de malato a oxalacetato es importante en las plantas, ya que aparece durante el ciclo de Calvin y la fotosíntesis C4 que consiste en la fijación de cuatro carbonos y separan en las dos células que tienen la superficie basal (célula del mesófilo y célula de la vaina) el proceso de la fotosíntesis.

Este proceso ocurre en el cloroplasto de una célula mesófila y se inicia cuando las plantas C4 forman fosfoenolpiruvato gracias a la fosfoenolpiruvato carboxilasa y lo convierten en oxalacetato, una molécula que tiene cuatro carbonos, que gracias a la MDH1 es reducido a malato, es decir, el NADH+ unido a la enzima se reduce y se convierte en NAD por lo que la malato recupera sus hidrógenos. Es necesario la conversión a malato ya que tiene la capacidad de pasar a las células de la vaina para que se produzca el ciclo de Calvin en estas células.

MALATO DESHIDROGENASA MITOCONDRIAL, MDH2 

La primera función de la malato deshidrogenasa mitocondrial es la participación de esta enzima en la vía de ácido cítrico, también conocido como Ciclo de Krebs, que tiene lugar en la matriz mitocondrial. 

Esta enzima lleva a cabo el último paso del ciclo de Krebs que consiste en la catálisis de la conversión de malato a oxalacetato. 

La proteína lleva a cabo esta reacción gracias a que una molécula de NAD se une a la enzima, y los hidrógenos del tercer carbono de la molécula de malato son captados por el NAD para formar NADH+. Para que la molécula de carbono que ha perdido los hidrógeno complete el octeto, se debe añadir un doble enlace con el oxígeno pasando de esta manera de malato a oxalacetato.

Imagen creado por BioRender

Además, como hemos mencionado anteriormente, la reacción de malato a oxalacetato es una reacción reversible que se puede llevar a cabo de oxalacetato a malato, pero esta reacción es catalizada por la malato deshidrogenasa citosólica. 

ACCIÓN CONJUNTA DE LAS DOS ISOFORMAS DE LA MALATO DESHIDROGENASA , MDH1 Y MDH2 

La malato deshidrogenasa tiene un papel fundamental en el transporte de electrones desde el citosol a la mitocondria, ya que constituye la lanzadera malato-aspartato.

Esta es esencialmente relevante en órganos como corazón, hígado o riñón y su función se basa principalmente en la translocación de electrones producidos en la glucólisis (citosol), que resultan de la reducción de la coenzima NADH, hasta la mitocondria, concretamente en su membrana interna. Por tanto, observamos el importante papel de esta enzima en la fosforilación oxidativa, esencial para la obtención de ATP en las células.

Por otra parte, como hemos mencionado, el mecanismo de esta lanzadera puede actuar en ambos sentidos, es un proceso reversible. Esto permite que se pueda adaptar y cambiar de dirección según las necesidades metabólicas de la célula. Cuando la lanzadera actúa de forma inversa, es decir, libera el oxalacetato de la mitocondria al citosol y por tanto se utiliza NADH mitocondrial y se genera NADH en el citosol.

En el mecanismo de la lanzadera malato – aspartato intervienen dos transportadores de membrana: transportador malato-α-cetoglutarato o transportador de dicarboxilato (SLC25A11) y transportador de glutamato-aspartato (SLC25A12 /  SLC25A13). Ambos son transportadores antiportes, es decir, introduce una sustancia mientras elimina otra, y se localizan en la membrana mitocondrial interna.

Además, intervienen cuatro enzimas: 2 unidades de malato deshidrogenasa, una citosólica (MDH1) y otra mitocondrial (MDH2) ; y dos unidades de aspartato transaminasa, uno citosólico y otro mitocondrial. Esta última también se denomina glutamato- transaminasa (GOT).

Pasaremos a explicar su mecanismo:

En el proceso de glucólisis, que tiene lugar en el citoplasma, resultan dos moléculas de NADH. Estas proporcionarán energía para producir ATP y, para ello, sus electrones deberán pasar a la matriz mitocondrial.

La MDH citosólica junto al NADH reduce el oxalacetato a malato y este último es transportado a la matriz de la mitocondria intercambiado por alfa-cetoglutarato (antiporte). Una vez en la matriz, actúa la MDH mitocondrial reduciendo NAD A NADH, provocando la conversión de malato a oxalacetato.

El oxalacetato, como hemos mencionado previamente, no podrá atravesar la membrana interna ya que no existe un transportador para ello, por tanto, la enzima aspartato transaminasa (AST mitocondrial) convierte al oxalacetato en aspartato. También convierte el glutamato en alfa-cetoglutarato.

El alfa cetoglutarato sale al citosol intercambiado por malato, mientras que el aspartato sale intercambiado por el glutamato. Finalmente, el alfa-cetoglutarato es convertido en glutamato y el aspartato a oxalacetato(AST citosólica) de nuevo.

Esquema lanzadera malato – aspartato. Autor: Angel Herráez (biomodel.uah.es)

En primer lugar, la consecuencia directa principal que implicaría un funcionamiento incorrecto de la malato deshidrogenasa es que genera un fallo en el ciclo de Krebs, impidiendo la regeneración del oxalacetato de nuevo, por lo que no se combinaría con el acetil-CoA y no se liberaría el CO2. Esta enzima también genera poder reductor (NADH) que resulta fundamental como “moneda energética” en todos los procesos celulares del organismo.

Además, un mal funcionamiento de esta enzima se traduce directamente en un mecanismo erróneo de la lanzadera malato – deshidrogenasa, por lo que el transporte de electrones del NADH al citosol no se daría correctamente. 

Todo esto influye por tanto en el transporte de electrones que tiene lugar en la membrana interna: los electrones no llegarían al oxígeno (aceptor final) por lo que no se produciría la reducción y la liberación de H2O. De esta manera, si el transporte de electrones no es correcto, la fosforilación oxidativa se verá afectada, disminuyendo la proporción de ATP y ADP .

Tejidos como el cardíaco, el esquelético, el encéfalo, nervioso …. que requieren y demandan mucha energía, se verían particularmente afectados por defectos en esta enzima ya que repercute de manera directa o indirecta en la respiración celular.

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Por Paula Rodríguez y Sara Vargas. Grado de Biología Sanitaria.

Introducción

En el interior de las células se realiza un tráfico constante de miles de moléculas y proteínas entre el núcleo y el citoplasma con el objetivo de realizar las numerosas tareas relacionadas con el genoma, como la reparación y el almacenamiento. Este es un proceso altamente regulado y selectivo llevado a cabo por unas proteínas flexibles capaces de reconocer secuencias y que median tanto la exportación como la importación. Los poros nucleares son las estructuras que conectan el núcleo y el citoplasma, y las importinas y exportinas (conocidas colectivamente como carioferinas) transportan moléculas de un lado a otro del poro.

En este artículo se va a tratar el papel de las importinas.

Papel biológico y su importancia

Las importinas son las proteínas encargadas del transporte entre el citoplasma de la célula y el núcleo. Este proceso se lleva a cabo a través de los complejos de los poros nucleares en un proceso llamado el ciclo de importación de proteínas nucleares. Se podría decir que la importina actúa como un GPS molecular, facilitando el transporte hacia el núcleo de unas proteínas específicas.

La importina es capaz de importar dichas moléculas gracias a secuencias de localización nuclear.

Es decir, como sería muy complejo crear una importina por cada tipo de proteína que haya que transportar al interior del núcleo, las proteínas con funciones nucleares tienen en su estructura una secuencia corta llamada señal de localización nuclear (NLS), que es reconocida por la importina y facilita el transporte de las proteínas a través de los poros nucleares hacia el núcleo. Estas secuencias no son idénticas en todas las proteínas que se importan, varían ligeramente, pero todas las variaciones pueden ser reconocidas por las importinas, y así les permite reconocer el tipo específico de molécula según esa secuencia.

Suelen ser secuencias de aminoácidos cortas formadas por grupos de residuos de carácter básico como lisinas y argininas. Que haya una mayor afinidad por la importina con la molécula depende de cada secuencia, y causa que ciertas moléculas entren al nucleoplasma con mayor facilidad.

Sin esta secuencia de localización nuclear, las proteínas no podrían ser reconocidas por las importinas y por tanto no podrían llegar a su destino nuclear ni llevar a cabo su función.

Estructura

Las importinas están formadas por un complejo compuesto por la importina-beta, importina-alfa y la carga. La importina-beta y la importina-alfa funcionan conjuntamente para transportar moléculas a través de proteínas del complejo del poro nuclear. Este complejo debe ingresar al núcleo donde la carga debe liberarse y las importinas deben reciclarse de regreso al citoplasma.

Si observamos la estructura de la importina, tanto la subunidad alfa como la beta se pliegan como un muelle que después se enrolla en una hélice. Es por ello que su estructura es todo alfa, es decir, está principalmente compuesta de hélices alfa. No se debe confundir el nombre de las subunidades con el tipo de estructura secundaria que presentan. Tiene sentido que esta proteína sea todo alfa ya que esta debe ser soluble y no crear precipitados. La estructura deja en el interior todas las uniones que sostienen la hélice.

Mecanismo de acción de la proteína

Las importinas transportan constantemente miles de proteínas diferentes desde el citoplasma al núcleo. El transporte a través del poro nuclear está determinado por un gradiente energético de unas moléculas llamadas Ran.

La proteína Ran, es la responsable de liberar la carga y crear direccionalidad en el transporte. Para ello, la proteína Ran se une a importina-beta y provoca un cambio significativo en la estructura, lo que lleva a la liberación de importina-alfa y la carga. Luego, el complejo de importina-beta y Ran viaja de regreso al citoplasma a través del poro.

En el proceso de la importación encontramos que en el citoplasma se crea el GDP y se une a las moléculas Ran creando el complejo Ran-GDP. Una vez que la molécula importada traspasa el poro entrando en el nucleoplasma, las Ran-GDP son rápidamente convertidas en Ran-GTP, manteniendo un gradiente RanGDP en el citoplasma y RanGTP en el núcleo y dejando a la importina-beta lista para transportar la siguiente proteína de carga al interior. El gradiente de las proteínas Ran a través del complejo del poro nuclear es esencial y asegura la dirección correcta del transporte.

En cambio, la importina-alfa no puede regresar al citoplasma por sí misma, por lo que la proteína CAS (factor de exportación nuclear) debe participar en el proceso. CAS es similar a importina-beta, pero se mueve a través del poro nuclear en la dirección opuesta. CAS se une a importina-alfa y Ran para sacarlos del núcleo. Por último, una escisión similar del GTP en Ran libera importina-alfa para poder estar disponible para transportar otra proteína de carga.

Cuando la importina ya ha reconocido a la proteína por su secuencia de localización celular y se une a ella, lo denominamos complejo importina-carga.Las nucleoporinas (proteínas que componen los poros nucleares) interaccionan con la importina y utilizando el gradiente Ran mencionado para crear direccionalidad en el transporte. Una vez en el nucleoplasma, la presencia de altos niveles de Ran-GTP causa que el complejo importina-carga se destruya, liberando así la carga en el interior del núcleo.De esta manera, los complejos importina-carga que se han formado espontáneamente en el citoplasma, atraviesan el poro y son disgregados en importina más carga por las Ran-GTP del nucleoplasma. La importina después regresa a través de los poros de vuelta al citoplasma.

Implicaciones biomédicas y patologías asociadas a su mal funcionamiento

La actividad de las importinas está estrechamente relacionada con implicaciones biomédicas en los ámbitos de genética, bioquímica y biología molecular. Un mal funcionamiento del transporte entre el núcleo y el citoplasma puede influir en la aparición de muchas enfermedades y patologías asociadas a mutaciones o cambios en la estructura de la importina-α e importina-β.

Se han realizado estudios que demuestran que alteraciones en las importinas pueden estar relacionadas con cáncer. El mal funcionamiento en el transporte nuclear puede llevar a cambios tanto a nivel fisiológicos como en la ubicación de los supresores de tumores, protooncogenes y otras macromoléculas que afectan a procesos relacionados con tumores y la sensibilidad a los fármacos de células cancerosas. Los estudios de cáncer de mama han demostrado que el mal funcionamiento de las proteínas supresoras de tumores depende de la localización celular. En muchos de los tejidos de cáncer de mama la p53 se encuentra en el citoplasma en lugar del núcleo. p53 contiene señales de localización nuclear putativas (NLS) que interactúan con la importina α.

Además de sus funciones de transporte nuclear en la interfase, los receptores de transporte nuclear de carioferina también tienen funciones importantes en la mitosis y la integridad cromosómica. Por lo que alteraciones en las funciones regulares de las carioferinas pueden tener efectos sustanciales en el curso y resultado en enfermedades.

La actividad de la importina también está asociada con ciertas patologías relacionadas con la actividad de virus. Experimentos recientes han demostrado que en la infección del virus Ébola inhibe de la importación nuclear de PY-STAT1 ya que el virus evita que la importina-α entre al núcleo. Como resultado, la importina no es funcional y la proteína de carga permanece en el citoplasma lo que produce una reducción en la respuesta inmunitaria del huésped.

Por último, varios estudios han demostrado la relación entre las importinas y los procesos de gametogénesis y una posible relación con la infertilidad masculina. Como resultado, se ha demostrado que las contribuciones de las importinas al desarrollo celular no se basan solo en el movimiento de carga a través de los poros nucleares sino que también pueden tener relevancia en muchas enfermedades y patologías celulares.

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Trabajo realizado por Adrián Agúndez, María Brage, Marta Crespo y Lucía Martín

Introducción

La succinil-CoA sintetasa es una de las enzimas más importantes en nuestro organismo debido a la vital importancia que presenta en el metabolismo celular. Esta enzima que participa en el ciclo de Krebs es esencial en el mantenimiento de la ruta metabólica, por lo que es muy importante mantener su correcto funcionamiento, así como su estructura. En caso de que estas se vean afectadas, se pueden provocar diversos problemas en su papel biológico y mecanismo, lo cual resultaría en la aparición de diversas enfermedades que posteriormente explicaremos. 

Papel biológico

• Generación de nucleótidos trifosfato:

Se trata de la única proteína del ciclo de Krebs capaz de catalizar una reacción en la que mediante una fosforilación a nivel de sustrato se forma un nucleótido trifosfato. Existen casos como el de la Escherichia coli, en el que el SCS (succinil-CoA sintetasa)  puede catalizar tanto la formación de ATP como de GTP. En los mamíferos no se da este caso; diversos estudios han demostrado que de la formación de estos nucleótidos trifosfato se encargan distintas isoformas de esta enzima. Su localización puede variar. En el caso de los humanos la SCS que cataliza la formación del GTP se encuentra mayoritariamente en células hepáticas mientras que la responsable de la formación del ATP predomina en las células de los músculos del pecho. Se puede ver cómo existe cierta relación entre que los tejidos que participan en el metabolismo anabólico (hígado, riñones) expresen SCS-GTP y que aquellos que intervienen en el catabólico (corazón, cerebro, músculo) presenten SCS-ATP.

• Formación de intermediarios metabólicos:

Por otro lado, controla la reacción reversible de succinato a succinil-CoA gracias a que facilita el grupo de moléculas en otras rutas metabólicas. Esto le hace ser un intermedio necesario para la síntesis del grupo hemo, porfirina y cuerpos cetónicos.

• Regulación e inhibición:

Gracias a la investigación sobre la regulación  de esta enzima en la Escherichia coli, se ha demostrado que esta es regulada a nivel transcripcional. El gen de la proteína es transcrito con el de la -cetoglutarato deshidrogenasa. Este operón (unidad genética funcional) se activa con oxígeno y responde a diversas fuentes de carbono.

Unos inhibidores potentes de la SCS bacteriana son los fármacos antibacterianos, los cuales previenen la fosforilación de la histidina. Un ejemplo de este tipo de moléculas es Y26650.

Estructura

La succinil CoA sintetasa es una enzima, que forma parte del ciclo de Krebs, se trata de un heterotrímero a2b2, la unidad funcional es la pareja ab. El mecanismo de la enzima muestra que primeramente se transfiere el grupo fosforilo al succinil-CoA unido a la subunidad a (morada), y a continuación se transfiere al nucleósido difosfato (zona naranja) unido a la subunidad b (cian).

El estudio de la estructura de esta enzima ha revelado que los dominios amino terminales de las dos subunidades presentan estructuras diferentes, llevando a cabo cada uno, una parte importante del mecanismo de la enzima. El dominio amino terminal de la subunidad a presenta un plegamiento de Rossmann, el cual se une al componente ADP del succinil-CoA. Por otro lado, el dominio amino terminal de la subunidad b es un dominio captador de ATP. El mecanismo de la enzima funciona por tanto de la siguiente manera: El residuo de histidina (His246a) atrapa al grupo fosforilo de la CoA y lo transfiere al nucleótido unido al dominio garra de ATP (zona naranja)

El enlace entre el succinato y la coenzima A es particularmente inestable y proporciona la energía necesaria para construir una molécula de ATP.

Además, en la imagen de la proteína observamos la presencia de dos iones que son cofactores, esenciales para el correcto funcionamiento de la enzima:

·   El magnesio (ion rojo) es un mineral esencial y un cofactor para cientos de enzimas. El magnesio está involucrado en muchas vías fisiológicas, incluida la producción de energía, la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas, el transporte de iones, la señalización celular y también tiene funciones estructurales.

·   El potasio desencadena la activación de enzimas y es esencial para la producción de adenosina trifosfato (ATP).

Mecanismo

Tal y como se ha dicho anteriormente, la succinil-CoA sintetasa es una enzima que cataliza la reacción reversible desde succinil-CoA a succinato en el ciclo de Krebs. Esta reacción permite la formación de un nucleótido trifosfato (ATP o GTP) mediante una fosforilación a nivel de sustrato. La succinil-CoA sintetasa presenta dos regiones importantes en esta reacción: la primera de ellas es su centro activo, al cual se une la succinil-CoA y es donde se lleva a cabo la transformación de este compuesto; en la segunda región, ubicada cerca del extremo N-terminal de la subunidad beta, encontramos un residuo de histidina (His246), el cual es esencial en la obtención del nucleótido. De esta manera, la reacción de producción de succinato se lleva a cabo en tres fases:

1. Formación de succinil-fosfato. En primer lugar, la succinil-CoA se une a la enzima por el centro activo y se produce un desplazamiento de la CoA por una molécula de fosfato, formándose así el succinil-fosfato.

2. Formación de fosforil-histidina. En segundo lugar, la enzima elimina el fosfato del succinil-fosfato fosforilando el residuo de histidina. Esto da lugar a la formación de succinato, el cual sigue transformándose en el ciclo de Krebs. Además, se genera 3-fosforil-histidina, un producto intermediario de alta energía.

3. Formación de nucleótido trifosfato. Por último, la histidina fosforilada transfiere el grupo fosfato a un nucleótido difosfato, generándose así el nucleótido trifosfato, el único que se obtiene directamente en todo el ciclo de Krebs.

Papel biomédico

Como se ha mencionado, la succinil CoA sintetasa es una enzima muy importante en el metabolismo, por lo que puede estar implicada en algunas enfermedades.

La subunidad β de esta enzima tiene especificidad para el GDP o ADP; está codificada por la proteína SUCLA2 para la subunidad con especificidad para ADP, y por la proteína SUCLG2 para la subunidad con especificidad para GDP, mientras que la subunidad α es compartida para ambos, y está codificada por el gen SUCLG1.

La deficiencia de la succinil-CoA sintetasa puede ser muy perjudicial para el organismo, y puede causar enfermedades, como por ejemplo la acidosis láctica.

La acidosis láctica es una enfermedad que se produce por una mutación en la succinil coa sintetasa, perjudicando el ciclo de krebs, ya que se produce la acumulación de ácido láctico, que crece hasta niveles muy elevados, por lo que se vuelve tóxico.  

La mayoría de los casos afectan a neonatos o niños muy pequeños. Los síntomas pueden ser vómitos, aumento de la frecuencia y profundidad de la respiración (polipnea), debilidad muscular (hipotonía) y cansancio y somnolencia (letargo). Además, puede ocasionar dismorfismo facial, malformaciones cerebrales y otros problemas en los órganos como la miocardiopatía hipertrófica, tubulopatía o insuficiencia hepática. El diagnóstico se hace a partir de análisis de sangre, esta muestra acidosis metabólica y una gran acumulación de ácido láctico, que suele ser mayor que 10 mM.

Esta enfermedad puede ser leve si hay mutaciones en el gen SUCLA2 (codifica la subunidad beta), que  está presente principalmente en el cerebro, el músculo esquelético y el corazón; por lo que los síntomas de los pacientes estarán relacionados con daños en esos órganos. Esta es conocida como acidosis láctica tipo B.

La acidosis láctica tipo A se produce por mutaciones en el gen SUCLG1 (falta un par de bases del gen); que se expresa en gran medida en el corazón, en el cerebro, en el hígado y en el riñón. Esto provoca que la succinil-CoA no sea funcional en el metabolismo, y por lo tanto las células se ven obligadas a producir ácido láctico para producir ATP, por lo que este se acumula y causa la enfermedad. 

En estos casos, la enfermedad es muy grave, y provoca la muerte entre 2 y 4 días después del nacimiento. 

Además de la acidosis láctica, diversos estudios han mostrado que esta enzima puede estar implicada en la enfermedad de Carrión. 

La Bartonella bacilliformis es el agente causante de esta enfermedad, que si no se trata tiene una tasa de mortalidad del 40-85%. Actualmente la enfermedad de Carrión la padecen habitantes pobres de los valles andinos de Ecuador, Colombia y Perú, y por ello no está muy estudiada.

No hay una técnica de diagnóstico correcta, por lo que se realizó un estudio para identificar nuevos antígenos de la bartonella bacilliformis, lo que es esencial para el desarrollo de una herramienta de diagnóstico barata y sensible, para que pueda ser usada en países con pocos ingresos. 

Se recolectaron muestras de sangre y suero en el norte del Perú. Cuando se registraron los datos, cuatro proteínas se consideraron posibles candidatos antigénicos, además de la subunidad α  y la subunidad β de la succinil-CoA sintetasa.

En el estudio, la succinil Co-A sintetasa α interactuó con la IgM, mientras que la β interactuó con IgG. La presencia de anticuerpos específicos contra los candidatos antigénicos varió del 34,5% al 97,2%. 

Por lo que se demostró que estos nuevos antígenos podrían usarse como una nueva herramienta de diagnóstico rápido para la enfermedad de Carrión y para identificar portadores asintomáticos.

Referencias

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Por Rafael López Rodríguez y Elena Mozos Ruiz. Biología sanitaria, UAH

INTRODUCCIÓN 

El ántrax es una enfermedad bacteriana causada por la Bacillus anthracis que afecta principalmente a los herbívoros, siendo humanos y carnívoros huéspedes accidentales. La bacteria produce tres proteínas, el antígeno protector (PA), el factor letal (LF) y el factor de edema (EF) Aunque rara vez aparece en humanos, sí que se dan casos de ántrax en algunos países no industrializados y últimamente se ha convertido en un peligro ya que puede ser utilizado como arma biológica.

ESTRUCTURA

La enfermedad del ántrax es causada por la Bacillus anthracis, una bacteria gram positiva, aerobia y con cápsula. Dicha bacteria tiene la capacidad de formar esporas muy resistentes cuando hay una falta de nutrientes, las cuales pueden sobrevivir durante décadas. Una vez expuesta de nuevo a un ambiente rico en nutrientes, como la sangre de un animal, recuperan su forma activa

La enfermedad realmente será causada por las toxinas producidas por la Bacillus anthracis, así como algunas características de su cápsula

Cápsula: 

La cápsula del B.anthracis está constituida por un polímero de poli-D-glutamato. No es tóxica, pero sí protege frente al sistema inmunitario del hospedador, ya que confiere resistencia contra la fagocitosis

Toxinas: 

Individualmente ninguna de estas tres proteínas es tóxica, su toxicidad se debe a la expresión y secreción de dos toxinas. Una mezcla de antígeno protector y factor edema forma la toxina edemática (EdTx), que provoca edema. Una mezcla de antígeno protector y factor letal forma la toxina letal (LeTx), que causa la muerte 

Esta toxina está formada por 3 componentes: el factor edema, factor letal y el antígeno protector 

El factor edema (EF) 

Es una adenilil ciclasa que utiliza el calcio como cofactor. El factor edema es activado cuando entra en la célula y se vincula a la calmodulina, una proteína muy común en nuestras células. Entonces, transforma el ATP a AMP cíclico, consumiendo ATP en el proceso. El AMPc interviene en la recepción de señales por parte de la célula, actuando como segundo mensajero dentro de ella. El EF provoca un gran aumento de AMPc intracelular y destruye el balance mantenido por las hormonas. Esto causa la aparición de un edema.

El factor letal (LF) 

Es una proteasa (rompe enlaces peptídicos) que utiliza el zinc como cofactor y que es altamente específica. Esta realiza un corte en la región amino-terminal de una familia de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPKK). De esta forma, el LF inactiva diferentes mecanismos de señalización celular

Esta proteína tiene 4 dominios: el dominio I participa en la unión a antígeno protector y el dominio II interviene en el reconocimiento y unión al sustrato. El dominio III está incluido dentro del dominio II, aunque su estructura consiste en una duplicación del dominio II. Y el dominio IV contiene el centro catalítico. Esta estructura revela una proteína que ha evolucionado por un proceso de duplicación, mutación y fusión de genes, dando lugar a una enzima con una actividad muy específica

El antígeno protector (PA) 

Es una proteína compuesta principalmente por láminas beta antiparalelas y que está formada por 4 dominios. El dominio I amino-terminal contiene la región de corte para la activación de proteasas, así como 2 iones de calcio. El dominio II, por otro lado, está implicado en la inserción a la membrana. El dominio III es pequeño y se desconoce su función. Por último, el dominio IV carboxilo-terminal, es el que participa en la unión al receptor. El antígeno protector forma un heptámero tras la eliminación de un fragmento amino-terminal del dominio I, esta estructura se inserta en la membrana y permite pasar al citosol a los factores tóxicos del ántrax.

MECANISMO DE ACCIÓN

El proceso es el siguiente. El antígeno protector es el mecanismo de unión a la célula. La bacteria lo secreta como una sola cadena, que llega hasta la membrana plasmática de una célula. Entonces, se une por lo menos a dos receptores de superficie celular distintos, y es cortado por una proteasa.

A continuación, se une a otras 6 copias de la proteína, formando un heptámero, que dará lugar a un poro. Y a este se unen EF y LF, ya que al separarse el fragmento amino-terminal, queda expuesto en PA un lugar de unión al cual se unen competitivamente EF y LF con alta afinidad. El complejo proteico formado ingresa a la célula por endocitosis mediada por receptor.

PA comienza a formar canales que producen la traslocación de EF y LF dentro del citosol, donde ejercen sus efectos tóxicos. 

PATOGÉNESIS

Las personas se infectan con ántrax cuando las esporas ingresan a su organismo. Cuando las estas entran, pueden activarse, distribuyéndose por el individuo y produciendo toxinas. Esto puede ocurrir cuando una persona las respira, bebe agua o ingiere alimentos que están contaminados con ellas. Dichas esporas también pueden penetrar en el organismo a través de heridas o rasguños en la piel. 

En el ser humano, el ántrax puede manifestarse de 3 formas distintas:

ÁNTRAX CUTÁNEO: 

Es la forma más común de infección por ántrax y se considera también la forma menos peligrosa. En él, las esporas penetran la piel a través de una herida o rasguño. Sin embargo, también puede ocurrir al entrar en contacto con animales infectados o productos de origen animal contaminados.

La infección se desarrolla generalmente entre 1 y 7 días después de la exposición. Los síntomas incluyen la aparición de pequeñas ampollas o la aparición de un forúnculo cutáneo (úlcera) con un centro negro. Sin tratamiento, hasta el 20% de las personas con ántrax cutáneo corren riesgo de muerte. No obstante, con el tratamiento adecuado, prácticamente todos los pacientes con ántrax cutáneo sobreviven.

ÁNTRAX PULMONAR

Cuando una persona inhala esporas de ántrax, puede desarrollar ántrax pulmonar.  Este se inicia principalmente en los ganglios linfáticos en el pecho antes de distribuirse por el resto del cuerpo, lo que finalmente causa graves problemas respiratorios y posiblemente, la muerte

Sin tratamiento, sólo alrededor del 15% de los pacientes sobreviven. Sin embargo, con un tratamiento adecuado, aproximadamente el 55% de los pacientes sobreviven

ÁNTRAX GASTROINTESTINAL

Se da por el consumo de alimentos contaminados, mal cocinados o tratados. Las esporas de ántrax pueden afectar a la garganta y esófago, el estómago y los intestinos.

Sin tratamiento, más de la mitad de los pacientes con ántrax gastrointestinal mueren, pero la tasa de mortalidad se reduce hasta el 40% recibiendo tratamiento.

ÁNTRAX POR INYECCIÓN

Recientemente, se ha identificado otro tipo de ántrax en consumidores de heroína en el norte de Europa: el ántrax por inyección. Los síntomas pueden ser similares a los del ántrax cutáneo, pero el ántrax por inyección puede distribuirse por el organismo con mayor rapidez y es más difícil de reconocer y tratar que el ántrax cutáneo

ÁNTRAX COMO ARMA TERRORISTA

El ántrax es una toxina que tiene un gran potencial para ser utilizada como arma bioterrorista o en una guerra biológica. Esto es debido a que sus esporas poseen una gran resistencia a la temperatura, presión, pH y radiación ionizante además de poder sobrevivir un gran número de años en el agua y en la superficie. 

El ántrax es utilizado como arma principalmente mediante el uso de aerosoles, provocando infección por ántrax pulmonar. Este tipo de la enfermedad es el más letal, al principio se manifiesta de forma parecida a una gripe, por lo que es difícil de diagnosticar, para cuando se reconoce la enfermedad suele ser demasiado tarde, pues normalmente la infección ya es sistémica, se produce un choque séptico y posteriormente la muerte.

Es considerada como el arma biológica más letal por la facilidad para producir y preservar sus esporas, a diferencia de otros agentes biológicos, que junto con su capacidad para contagiar y la resistencia de sus esporas previamente mencionada, la convierten en una amenaza terrorífica para toda la población. 

En 2001 se produjo en Estados Unidos un ataque bioterrorista, esporas del ántrax fueron distribuidas mediante el servicio postal de forma intencionada, 22 personas fueron contagiadas produciendo 5 muertes. Este suceso cambió la forma en la que el sistema respondería ante una amenaza así, aumentando el dinero destinado a mejorar la capacidad de afrontar un ataque de este tipo

REFERENCIAS 

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Redactado por Alba Cerrato Benítez, Laura Blanco García y María Ayala Molina. GRADO EN BIOLOGÍA SANITARIA, UAH

La isocitrato deshidrogenasa (IDH) es una enzima muy relacionada con el metabolismo de los carbohidratos. Esta enzima participa en la tercera reacción del ciclo de Krebs, catalizando el proceso de transformación del isocitrato en 2-oxoglutarato. Es la primera reacción de oxidación-reducción del ciclo en la que obtenemos poder reductor en forma de NADH. Esto hace que sea una importante proteína cuyas funciones explicaremos en el desarrollo de este trabajo.

La razón por la que escogimos esta enzima es por su importante papel en las dianas terapéuticas y en el desarrollo del cáncer. Recientes investigaciones han demostrado que la presencia de mutaciones en dos genes, IDH1 e IDH2 , se dan en los gliomas más comunes. Además, aunque no está muy claro si estas mutaciones están relacionadas con la esperanza de vida del paciente, existen estudios que apuntan a que las personas con estas alteraciones sobreviven durante más tiempo.

El estudio de este oncometabolito nos puede proporcionar información acerca del metabolismo de las células cancerosas y nos puede ayudar a descubrir nuevas líneas de investigación para el desarrollo de terapias contra el cáncer.

ESTRUCTURA

Actualmente, existen muchas isocitrato deshidrogenasas secuenciadas, sin embargo, el número de ellas con una estructura tridimensional resuelta está reducido. Concretando, solo encontramos las de los organismos Escherichia coli y Bacillus subtilis. Estas enzimas (IDH) catalizan la descarboxilación oxidativa del D-isocitrato, produciendo 2-oxoglutarato y CO2. Para ello es necesario NAD+ o NADP+ como coenzima y se produce NADH  o NADPH, respectivamente. 

Según su dependencia por la coenzima, podemos distinguir tres tipos fundamentales de IDH: 

• IDH NAD+ – dependientes: necesitan como coenzima al NAD+ para catalizar la reacción. Aparece fundamentalmente en las mitocondrias de organismos del Dominio Eucarya. También hay organismos del Dominio Bacteria. 

• IDH deshidrogenasas NADP+ -dependientes: requieren como coenzima al NADP+ para catalizar la reacción. Las encontramos en organismos de los tres Dominios: Eucarya, Bacteria y Archaea. 

• IDH con especificidad dual: utilizan tanto el NAD+ como el NADP+ como coenzima. Este tipo es el único que aparece en arqueas termófilos y en algunas bacterias.

En los seres humanos, existen tres isoformas de esta enzima:

• IDH3 dependiente de NAD+, cataliza uno de los pasos del ciclo de Krebs en la mitocondria. Es necesaria para la respiración celular.
• IDH1 y IDH2 son dependientes de NADP+, y por lo tanto aportan poder reductor a la célula en forma de NADPH. Se localizan en el citosol, y también en la mitocondria y el peroxisoma.

En el desarrollo de este trabajo nos centraremos en la estructura de la IDH1. 

La IDH1 es una proteína α/β, es decir, la estructura de esta proteína está constituida por la alternancia de láminas beta y hélices alfa, cuyo núcleo es hidrófobo. Puede formar un dímero de dos subunidades iguales o un tetrámero formado por dos dímeros, este último parece ser la forma funcional de la proteína. 

Podemos distinguir en cada subunidad 3 dominios: dominio grande, dominio pequeño y dominio “broche”. La dimerización y tetramerización que hemos mencionado anteriormente está mediada por interacciones a nivel de los dominios “broche” y de los dominios pequeños. 

Encontramos una lámina β que une los dominios grande y pequeño, y que además a ambos lados presenta dos surcos de naturaleza hidrofílica. En el surco formado por los dominios grande y pequeño de una subunidad y por el dominio pequeño de la subunidad adyacente encontramos el centro activo. Existen 2 sitios activos por cada dímero proteico.

PAPEL BIOLÓGICO

Las isocitrato deshidrogenasas son una familia de enzimas que catalizan la reacción de descarboxilación oxidativa de isocitrato en α-cetoglutarato (o 2-oxoglutarato) en el ciclo de Krebs. La regulación de la actividad enzimática de la isocitrato deshidrogenasa es muy importante para llevar a cabo las funciones biológicas. Estas enzimas tienen dos cofactores distintos: NAD⁺ y NADP⁺. En el caso de la IDH1, isoenzima en la que nos hemos centrado, el cofactor es el NADP⁺ (que utiliza como aceptor de electrones) y se encuentra principalmente en el citoplasma. Por lo tanto, otra de sus funciones será reducir NADP⁺ a NADPH. En el proceso de esta reacción se libera uno de los átomos de carbono del reactivo en forma de dióxido de carbono (CO₂) y dos átomos de hidrógeno, uno de los cuales se transfiere al transportador (NADP⁺), que lo utilizará para impulsar la rotación de la ATP sintetasa. La reacción que la enzima lleva a cabo en el ciclo de Krebs cuenta con un intermedio de reacción que es el oxalosuccinato.

Además del papel catabólico que tiene la enzima en el ciclo de Krebs, se ha demostrado que tienen una función importante en la defensa de la célula contra el daño oxidativo a través de la generación de NADPH. Asimismo, la IDH citosólica contiene una secuencia de direccionamiento peroxisomal de tipo 1 que se encarga de dirigir diferentes proteínas hacia los peroxisomas. También se han encontrado isocitrato deshidrogenasas citosólicas (IDH1) en peroxisomas de levaduras y de células hepáticas humanas y de rata y se ha podido demostrar que son necesarias para la β-oxidación de ácidos grasos insaturados. Su función en la β-oxidación es provisionar con NADPH a los peroxisomas.

En algunas células bacterianas solo existe un tipo de isocitrato deshidrogenasa (IDH) dependiente de NADP⁺, cuyas funciones y estructuras también han sido estudiadas. En el caso de estos organismos, la enzima actúa en un punto muy importante entre el ciclo de Krebs y el ciclo de glioxilato. Mediante la regulación de su actividad, se puede regular la cantidad de sustrato de las dos reacciones. La fosforilación de un aminoácido de Serina (Ser) que se sitúa en el sitio de unión al que se une el ion isocitrato-metal, la actividad de la IDH de las bacterias es regulada. Sin embargo, el mecanismo regulador que controla la IDH1 en mamíferos no está claro. Aunque las enzimas en mamíferos y en bacterias se parecen, tan solo comparten el 20% de similitud en su secuencia. Sin embargo, la secuencia de la IDH en mamíferos tiene una Serina en la posición equivalente a la que poseen las bacterias en su secuencia. Esto sugiere que las IDH1 de mamíferos también puedan tener un sitio de unión que pueda ser fosforilado.

MECANISMO DE ACCIÓN

Las diferentes conformaciones que adopta el complejo enzimático provocan cambios en la
estructura del centro activo. Podemos observar:

• Conformación abierta (inactiva): Si no hay isocitrato, el surco del centro activo está abierto y
  el surco posterior cerrado. La interacción entre el Asp279 del dominio pequeño con la Ser94
  del dominio grande estabiliza la estructura y, además, en la zona donde se encuentra el
  Asp279 encontramos una estructura extendida. Esa interacción impide la unión del isocitrato.
• Conformación cerrada (activa): Si la concentración del isocitrato y del catión divalente llega a un cierto nivel, se une al centro activo. Rompiendo la interacción (puentes de hidrógeno) entre el Asp279 y Ser94, produciéndose la expulsión del Asp279 y la interacción con el Ca²⁺. La estructura extendida que se encontraba en la zona donde se encontraba, adopta una
  estructura en hélice α. Esto permite la entrada del isocitrato. Se cierra el centro activo y se
  abre el surco posterior.

Este cambio conformacional que se produce entre la forma activa e inactiva se debe a un movimiento de bisagra de las láminas β que se encuentra entre el dominio «broche» y el dominio pequeño.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA: UNA ESPERANZA PARA EL CÁNCER

Los gliomas  son  los  tumores  primarios  más  comunes  del  sistema  nervioso  central, por lo que afectan a las funciones del corazón y la médula espinal.  Según la Organización Mundial de la Salud, los gliomas se clasifican de I a IV según su grado de malignidad. Recientemente, se ha descubierto una posible relación de la aparición de los mismos con las mutaciones en el exón 4 de los genes que codifican las isocitratos deshidrogenasas 1 y 2. En el caso de la isocitrato deshidrogenasa 1, con los gliomas de grado II-III o la leucemia mieloide aguda entre otros.

El gen IDH1 se encuentra localizado en 2q33.3 y su ARNm contiene 10 exones para codificar la isocitrato deshidrogenasa 1 (414 aminoácidos). En relación con las mutaciones, nos interesa especialmente el residuo 132 de la proteína, correspondiente a una arginina altamente conservada en todas las isoformas de la enzima, que va a sufrir cambios a distintos aminoácidos.

Cambio de aminoácido	N (%)
R132H	92,7
R132C	3,6
R132S	1,8
R132G	0,9
R132L	0,5
R132V	0,5

Como hemos observado, la mutación más frecuente es la que cambia una arginina por una histidina (R132H). Pero, ¿Qué consecuencias lleva asociadas dicha mutación? ¿Tanta importancia tiene el cambio de un único aminoácido?

Como se ha mencionado con anterioridad, la isocitrato deshidrogenasa salvaje (no mutante), está involucrada en la descarboxilación oxidativa del isocitrato a 2-oxoglutarato y dióxido de carbono con la reducción de NADP⁺ a NADPH. El NADPH obtenido se utiliza para la producción de glutatión reducido, un tripéptido encargado de neutralizar los radicales libres, toxinas y oxidantes que se generan en las células, favoreciendo la supervivencia celular y la anti-apoptosis.

Sin embargo, lo que ocurre al cambiar un aminoácido (arginina) del sitio activo de la enzima por otro (histidina) es que la enzima pierde su capacidad de catalizar la conversión de isocitrato a 2-oxoglutarato. En su lugar, la enzima adquiere la capacidad de catalizar la reducción dependiente del NADPH del 2-oxoglutarato a 2-hidroxiglutarato. Una de las consecuencias de la producción excesiva del oncometabolito, 2-hidroxiglutarato, es la formación e incremento de la malignidad de gliomas.

Además, el 2-hidroxiglutarato, al ser tan parecido en estructura al 2-oxoglutarato, funciona como un inhibidor de las enzimas dependientes de 2-oxoglutarato. Estas enzimas tienen un papel muy importante en el mantenimiento del equilibrio de las histonas y la metilación del ADN por lo que, un exceso de 2-hidroxiglutarato podría causar la hipermetilación de histonas y ADN y el bloqueo de la diferenciación celular.

Diversos estudios indican que la probabilidad de que un paciente que presenta dicha mutación se recupere, es mayor que la de un paciente que no la presenta en el caso de gliomas de bajo grado. Para el resto de gliomas, la situación varía: en algunas ocasiones resulta en un valor de pronóstico desfavorable y, en otras, aún no se ha encontrado relación. Además, ha resultado ser una herramienta útil para diferenciar los gliomas de otras lesiones benignas y diferenciar entre gliomas primarios y secundarios.

Estos descubrimientos han abierto un nuevo campo de investigación e innovación farmacológica: la búsqueda de inhibidores de las IDH mutantes.

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