Cromatografía de exclusión de hemoglobina

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C. Menor-Salván. Marzo 2022.

Transformación de metahemoglobina en hemoglobina en columna de sephadex

Columna de sephadex con hemoglobina oxigenada (rojo brillante, abajo) y hemoglobina sin oxigenar (granate, encima)

Para la separación de hemoglobina, usamos un tipo de sephadex con un tamaño de separación inferior a 5 kDa, lo que implica que la hemoglobina (MW 64.5 kDa) no debería ser retenida por la columna y debería salir con el volumen de exclusión (recordad: volumen necesario para eluir una proteína no retenida por la columna). La separación en sephadex nos permite estudiar una de las propiedades interesantes de la hemoglobina: la oxidación del hierro. La transformación de hemoglobina en metahemoglobina es importante también a nivel fisiológico. Por ejemplo, tóxicos como nitritos y nitratos, entre otros, producen metahemoglobinemia (oxidación del hierro del grupo hemo), afectando por tanto al transporte de oxigeno.

Oxidamos la hemoglobina Hb con ferricianuro Fe(CN)63- que a su vez se reduce a ferrocianuro Fe(CN)64-
El ferricianuro tiene color naranja rojizo y da soluciones naranjas, pero el ferrocianuro es amarillo y sus soluciones también son amarillas. Esto nos da una pista sobre lo que pasa en la columna. No hay que preocuparse: aunque el cianuro (CN–) es muy tóxico, los complejos hierro-cianuro no son peligrosos (y como biólogos, hay que entender la razón).

Ferrocianuro potásico (izquierda, color amarillo) y ferricianuro potásico (derecha, color rojo)
La oxidación y reducción de la hemoglobina es un proceso fisiológico y ocurre como respuesta a tóxicos. El mantenimiento de la hemoglobina con el hierro en estado reducido es esencial.
Cristales de ferricianuro potásico. Los complejos de hierro se caracterizan por sus vivos colores. Cristales obtenidos por Javier Camarón, estudiante de Química en la UAH.

Antes de añadir la disolución de metahemoglobina metHb (obtenida oxidando la Hb con ferricianuro), debemos pasar una solución de ditionito (S2O42-), que es un reductor fuerte. El ditionito es adsorbido por la columna, creando un medio reductor. Entonces, al añadir la metHb y comenzar a eluirla, se irá reduciendo gradualmente a Hb. Esta recupera su capacidad de unirse al oxígeno, por lo que irá captando el oxígeno disuelto en el tampón al ir desplazándose por la columna.  Por ello esperamos un cambio de color. El ferrocianuro (con “o”) resultante de la oxidación de la hemoglobina, junto con restos de ferricianuro si estaba en exceso, queda retenido por la columna de exclusión, dado su pequeño tamaño (0.211 kDa), por lo que formará una mancha amarilla en la columna por encima de la hemoglobina.

Fases del experimento e interpretación de las observaciones. En la fase inicial (derecha) la metahemoglobina se separa del ferrocianuro. La metHB se va reduciendo y recuperando la capacidad de captación de oxígeno.
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