CRISPR-Cas: mecanismo molecular, historia y aplicaciones en potencia.

Andrea Delgado Ruiz y Néstor Román Cueva Ramírez. Grado en Biología Sanitaria, Universidad de Alcalá.

El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo de defensa presente en bacterias y archeas cuyo objetivo es degradar aquel material genético exógeno que trate de invadir el organismo. 

Como su propio nombre indica, el complejo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) consta de una región promotora encargada de regular la transcripción seguida de varias secuencias palindrómicas de pequeño tamaño que se repiten constantemente en el genoma y que, además, están interrumpidas por otras secuencias no repetidas y similares en tamaño que reciben el nombre de espaciadores (spacers). Dichos espaciadores se corresponden con fragmentos genéticos de origen extra cromosómico que el microorganismo adquiere tras entrar por primera vez en contacto con un patógeno, tratándose así de un curioso sistema de inmunidad adquirida con memoria. 

Además del complejo CRISPR, también es necesaria la presencia de los genes Cas, cuya expresión dará lugar a las endonucleasas encargadas de cortar y degradar el material genético exógeno. En función de la endonucleasa que se exprese, podemos diferenciar tres tipos de sistema: CRISPR I activa a Cas3, CRISPR II activa a Cas 9 y CRISPR III activa a Cas6. De estos tres sistemas, el más empleado en ingeniería genética actualmente es CRISPR-Cas9 debido a la alta tasa de eficiencia de la endonucleasa Cas9. 

El proceso inmune mediado por este sistema puede dividirse dos fases: 

1. INMUNIZACIÓN: Incorporación de secuencias espaciadoras tras la exposición al patógeno. 

Cuando la célula huésped (bacteria u archea) entra por primera vez en contacto con un organismo patógeno detecta su material genético y lo reconoce como exógeno. Este reconocimiento es gracias a la presencia de una secuencia específica en el DNA conocida como motivo adyacente del protoespaciador (PAM). Tras el reconocimiento de esta secuencia PAM, la célula incorporará los nucleótidos adyacentes a esta al genoma como un nuevo espaciador. 

*Durante este proceso, una de las secuencias palindrómicas repetidas se duplica, y así el nuevo espaciador queda flanqueado en el genoma por una secuencia repetitiva a cada lado. 

2. INMUNIDAD: Formación y actuación del complejo CRISPR-Cas. 

La región CRISPR se transcribe dando lugar a un RNA largo y no codificante denominado pre-crRNA. En el caso del sistema CRISPR-Cas9, se transcribe adicionalmente otro RNA no codificante que es complementario a la secuencia palindrómica repetida y que recibe el nombre de tracrRNA. Este se va a unir a las secuencias repetidas del pre-crRNA formando un dímero crRNA/tracrRNA que será reconocido por una RNAsa III, la cual se encargará de procesar y generar un crRNA maduro. 

Finalmente, la endonucleasa Cas, se asocia a el crRNA maduro formando el complejo CRISPR-Cas. Será este crRNA maduro el encargado de guiar al complejo hasta el blanco, es decir, hasta reconocer una secuencia complementaria que será degradada por la acción de Cas. 

Como curiosidad, la gran variedad de elementos genéticos invasores ha favorecido que bacterias y archeas evolucionen creando distintos tipos de enzimas Cas para generar una respuesta inmune más efectiva, las cuales, además de la actividad de corte, poseen otras funciones auxiliares específicas de cada tipo.

Figura 1. Editada y traducida (2022) en BioRender.com. Reprinted from «CRISPR-Cas9 Adaptive Immune System of Streptococcus pyogenes Against Bacteriophages», by BioRender, July 2020.

Para poder llegar a describir con precisión todos los pasos de este curioso mecanismo molecular fueron necesarios muchos años de investigación en los que se vieron implicados numerosos científicos a nivel internacional. Sin embargo,  el origen de este gran descubrimiento tiene lugar en España allá por el año 1987, cuando dos jóvenes microbiólogos, uno en Alicante (F. Mojica) y otro en Utrecht, se dedicaron a estudiar una serie de elementos genéticos repetitivos presentes en la bacteria Escherichia coli. Posteriormente, en el 2000, se encuentran estas mismas secuencias repetitivas en muchas otras especies bacterianas y se observó que junto a estas regiones repetitivas se encontraban cuatro genes distintos presentes en muchos otros procariotas también, situados de manera invariable respecto a las repeticiones.  En el 2002 se hizo referencia por primera vez al nombre CRISPR, con el que se denominó a estas repeticiones por las características que tenían como ya se ha comentado previamente. Los genes asociados fueron denominados cas. 

En el 2005 Mojica encuentran similitudes entre los espaciadores asociados a cispr y el material genético de ciertos virus que afectan a bacterias, sospechando vinculación de estas secuencias con la inmunidad de los virus, lo que sientan las bases para el posterior desarrollo de las aplicaciones; hipótesis que fue demostrada experimentalmente dos años después. En ese momento empezó a investigarse la manera en la que actuaban sistemas inmunes CRISPR; en 2012 se descubrió que se genera un corte asociado a CRISPR para fragmentar el DNA y que el factor estrella de este proceso es la proteína cas9. El hecho del descubrimiento de la actividad endonucleasa de este sistema y su alta especificidad para los sitios de corte hizo replantearse la posibilidad de usarlo como sistema de edición génica. De hecho, este mismo año, se hicieron los primeros cortes con este sistema; en un tubo de ensayo, el primero de todos, realizado por un equipo liderado por Doudna y Charpentier, y en una célula viva de mamífero más tarde. 

A partir de este momento se empieza a entender este sistema como un conjunto (CRISPR/Cas9). En 2013, tras estos últimos experimentos, surge el boom de esta técnica y se le da empieza a dar real importancia; en los años anteriores prácticamente había pasado desapercibida. El motivo de tanto alboroto es que esta técnica suplía las carencias de otras técnicas de edición genética anteriores, como la complejidad, alto coste y escasa eficacia. Aunque hoy en día sea considerado uno de los sistemas más eficientes y precisos, su potencial aún es una incógnita.

Figura 2. Timeline de la historia de CRISPR-CAS9, creada por los autores de la entrada (2021).

Está técnica revolucionaria en la edición genética ofrece oportunidades prácticamente ilimitadas. Solo con conocer la secuencia objetivo y que el gen que se desea modificar se encuentre junto a un motivo PAM, se puede cortar, pegar o editar. Por tanto, esta herramienta se utiliza en casi cualquier ser vivo, así como en campos muy dispares.

En humanos se utiliza en medicina, para prevenir y tratar enfermedades de distintos tipos; genéticas, virales, mentales e incluso cáncer, para realizar diagnósticos o para modificar animales y conseguir tejidos parecidos a los humanos que puedan usarse en trasplantes. En animales se puede usar en la industria cárnica, para mejorar las carnes de consumo, así como para erradicar especies. Se han conseguido también plantas con diversas resistencias (a plagas, enfermedades..) así como mejoradas genéticamente para aumentar su consumo o mejorarlo.

Todos estos ejemplos son solo una pequeña demostración de todo lo que se puede conseguir con esta herramienta y para hacernos a la idea de todo lo que aún está por conseguir.

En los últimos años, gracias a ella, se han conseguido verdaderos progresos. En 2019, mediante la genética dirigida, se consiguió erradicar una población en cautividad del mosquito Anopheles,  vector transmisor de la malaria. Esta técnica consiste en alterar la transmisión mendeliana mediante la modificación de genes sexuales de una especie. De esta manera, se consigue una mayor y más rápida propagación de un gen de interés. Para ello se copia un gen del cromosoma sexual beneficioso de uno de los progenitores en el cromosoma sexual del otro progenitor. Así, en la población femenina de este mosquito se introdujo una mutación que produce esterilidad femenina, consiguiendo eliminar la población completa en 10 generaciones. Esta técnica no ha obtenido resultados tan exitosos en mamíferos. 

Figura 3. [Mechanism of Gene Drive]. (2017). http://blogs.plos.org/dnascience/files/2017/11/journal.pbio_.2003850.g001.png

Por supuesto, esto conlleva una serie de implicaciones éticas importantes. En el caso anteriormente expuesto, erradicar una población de una especie puede tener importantes consecuencias en el medio ambiente. Por otro lado, editar genes ofrece la posibilidad de diseñar humanos. Por tanto, todas las aplicaciones de CRISPR-Cas necesitan estar reguladas y llevar un control de seguridad y eficacia.

REFERENCIAS:

• Montoliu, L. M. (2021). Prólogo. En F. M. Mojica (Ed.), Editando genes: recorta, pega y colorea (3.a ed., pp. 22–27).
• Herrera-Cabrera, B.E.; Salgado-Garciglia, R.; López-Valdez, L.G.; Reyes, C.; Montiel-Montoya, J.; Zaragoza-Martínez, F.; Guillermo Lucho-Constantino, G. y Barrales-Cureño, H. J. Edición genómica con CRISPR/Cas9: Premio Nobel de Química 2020. Revista de Química, 2021, 35(1), 22-30 http://revistas.pucp.edu.pe/index.php/quimica/article/view/23324
• Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., Sanjana, N. E., & Zhang, F. (2017). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature protocols, 12(4), 828–863. https://doi.org/10.1038/nprot.2017.016
• María Fernanda Lammoglia-Cobo, Ricardo Lozano-Reyes, César Daniel García-Sandoval, Cynthia Michelle Avilez-Bahena, Violeta Trejo-Reveles, Rodrigo Balam Muñoz-Soto, César López-Camacho (2016). The revolution in genetic engineering: CRISPR/Cas system. https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2016/ir162e.pdfç
• Jiang, F., & Doudna, J. A. (2017). CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual review of biophysics, 46, 505–529. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-062215-010822
• Sternberg, S. H. (2019). La revolución biológica de la edición genética con tecnología CRISPR. OpenMind. https://www.bbvaopenmind.com/articulos/la-revolucion-biologica-de-la-edicion-genetica-con-tecnologia-crispr/