LUCIFERASA

Realizado por: Iker Carretero, Andrea Arnedo y Pedro Castellano

INTRODUCCIÓN

Cientos de reacciones químicas simultáneas ocurren en nuestro cuerpo esenciales para la vida produciéndose en una escala de tiempo razonable. Por ejemplo, la glucosa puede pasar, mediante la acción de enzimas, a C02 y H20 y proporcionar una gran energía. Sin embargo, algunas otras reacciones necesitan el aporte energético necesario para que la reacción se lleve a cabo, este aporte es dado por las enzimas. Aceleran las reacciones.

Las enzimas son proteínas formados por aminoácidos unidos entre sí por enlaces covalentes cuya función es la catalización de una gran variedad de reacciones químicas. Una enzima puede sólo por aminoácido so tener un componente no proteico, si es así, se denominan holoenzimas. Estas poseen una parte proteica llamada apoenzima. Si la parte no proteica está unida débilmente a la parte no proteica se le denomina cofactor o grupo prostético si está unida fuertemente a la apoenzima. Los cofactores se clasifican a su vez en inorgánicos (iones metálicos) e orgánico (vitaminas). Veamos un esquema de la clasificación:

Los aminoácidos fijadores (fijan el sustrato) y catalíticos (debilitan y modifican los enlaces de los sustratos) junto con la parte no proteica de la enzima, forman parte del Centro activo de la enzima

Se caracterizan por unas cavidades en la estructura dimensional llamadas centro activo las cuales sienten mayor afinidad por las moléculas específicas, llamadas sustratos que se convertirán en otras llamadas productos. La transformación del sustrato, como cualquier catalizador, se libera el producto del sitio activo. La enzima puede volver a catalizar otras reacciones químicas, esto es una propiedad fundamental de las enzimas.

Tiene como finalidad acelerar procesos, algunos de ellos implicados en el metabolismo.

Pero, ¿qué guía o determina el pegamiento de una proteína?, estas se pliegan dependiendo de la secuencia de aminoácidos que las componen y forman entre sus dobleces ciertas cavidades con afinidad hacia diferentes moléculas. Algunas enzimas incluyen átomos de hierro, cobre y cinc y es por esto por lo que es necesario que la estructura de la enzima se mantenga.

La luciferasa, por lo tanto, es una enzima de la clase de enzimas oxidativas que produce bioluminiscencia y como producto de la catalización de una reacción química. Ilyina, A. D., Cerda, F. R., Estrada, B. C., Dukhovich, A. F., Gaona, L. G. J., Garza, G. Y., & Rodríguez, M. J. (1998).

Además de las moléculas de luciferina y oxígeno participa también la molécula de adenosintrifosfato (ATP).

MECANISMO DE REACCIÓN DE LA LUCIFERASA

Se destacan varias propiedades interesantes de la enzima: el gran cambio conformacional que se produce en presencia de los sustratos, la extrema hidrofobicidad natural por el sitio de unión, la capacidad de la enzima a agregar concentraciones de baja proteína manteniendo la actividad enzimática completa entre otras, (by Marlene Deluca)

Un esquema de la reacción catalizada por la luciferasa:

La estructura del sustrato de la luciferina LH2, un inhibidor competitivo dehidroluciferina (L), el producto, la oxiluciferina. El sustrato es una D-LH2 ya que L-LH2 está inactiva.

El COOH reacciona con el grupo ATP y se forma el luciferiladiato (E-LH2AMP). La temperatura necesaria para la reacción es de 25 grados.  Estas reacciones son análogas a las reacciones de activación de los ácidos grasos y proteínas en las que el grupo carboxílico está unido a un grupo fosfórico de AMP a través de un enlace anhídrido. El luciferiladiato en la siguiente reacción reacciona con oxígeno y produce la luz, CO2 y AMP, junto con el producto, la oxiluciferina.

Es requerida mucha energía ya que un solo protón verde requiere la misma cantidad de energía que la ruptura de 8 moléculas de ATP. Así que, crean luz mediante un proceso complejo. La luciferina, su cofactor se rompe, formando CO2 en el proceso, emite la luz. Información de pdb101.rcsb.org/motm/78.


Imagen Luciferasa con oxígeno, imagen propia pasada en PDB 101 2D1S
  • La luciferina, una substancia luminiscente, se oxida por la acción catalizadora de la enzima luciferasa. Esta reacción requiere de un agente oxidante, como el oxígeno molecular o el peróxido de hidrógeno, y continúan con la formación de complejos intermedios. Cuando se descomponen, se libera energía, la cual excita moléculas de una sustancia la cual emite fotones.

La frecuencia de la luz depende de su energía y, por tanto, del tipo de luciferina.

En algunos casos el trifosfato de adenosina y ATP, participa en la reacción luciferina-luciferasa. Característico del ciempiés, la mosca del hongo y de las luciérnagas.

Sin embrago, en la medusa Aequorea, la bioluminiscencia se debe a la interacción de una proteína específica de la equorina con los iones de calcio y sin la participación del oxígeno.

Club de Inmersión Biología :: 06. Cnidarios-Medusas, Aequorea forskalea

Tanto luciferinas como luciferasas en distintas especies no son químicamente idénticas. La luciferasa varía un poco en su estructura primaria, en la dependencia al pH del proceso catalítico y en algunos parámetros cinéticos.

No obstante, el esquema de la reacción y la estructura de la luciferina son semejantes para diversas luciferasas.

Por cada molécula de luciferina se gasta una molécula de oxígeno y se forma una molécula de CO2. DE manera que, el ATP, el Mg2+ y la luciferina tienen sitios de unión diferentes a la enzima.

La luciferasa también cataliza la formación de dehidroluciferil-adelinato (L-AMP). Esta reacción puede estar seguida de una disminución de fluorescencia, ya que L-AMP emite una débil luminiscencia comparada con la intensidad de fluorescencia de L.

En la reacción 3 se comprueba la reversibilidad de la reacción. La Dehidroluciferina es un potente inhibidor de la luciferasa con K 1*10-6 M.

Si la luciferasa pudiese reaccionar con exceso de L y ATP-Mg con presencia de pirofosfato 2P, habría un continuo hidrólisis de ATP a AMP y 2P. Esta hidrólisis ocurre como resultado de la caída de L-AMP con la síntesis de otra L-AMP usando más ATP. El efecto neto es esencialmente de una ATPasa.

CONCLUSIÓN: El ATP estimula la hidrolisis de E-L-AMP, dejando libre L de la enzima.

  • Si no hay exceso de L-AMP, L reacciona con otra molécula de ATP para producir una nueva L-AMP y 2P.
  • Si hay exceso de L-AMP, el L-AMP desplaza L de la enzima es hidrolizada, produciendo un aumento de fluorescencia.

 (By Marlen Delucas de Advaneces In Enzimology ande Relalted Areas of Molecular Biology  which belongs to Cornell univeristy medical college, New York)

El oxígeno, Mg2+ y el ATP que participan en la reacción no inhiben a la enzima. Sin embargo, cuando se emite luz después de un máximo de intensidad se observa un período de reducción rápida de la intensidad. Esto se explica por la inhibición de la enzima con el producto o por lo cambios de conformación enzima-substrato.(By  Sociedad Química de México, in the jorunal of the mexican chemical society,1998,vol.42,num.3)

FORMACIÓN DE UN CROMÓFORO

Un cromóforo se transforma durante la reacción la luciferina, de la cual se han reportado tres isómeros. El color depende del pH y polaridad del medio.

  • pH básico o neutros ocurre la enolación del producto y la luz roja emitida tiene una longitud de onda de 560 nm.
  • pH Ácido produce una luz roja con un máximo de longitud de onda de 620 nm, se encuentra generalmente en su forma ceto no ionizada
  • Al agregar etanol a un pH 2.5 se observa una región azul a 445nm.

(información aumentada con pdb-101 2d1s) Esto está asociado con los aminoácidos que rodean a la luciferina. Normalmente emite esta luz verde-amarilla pero si cambias un aminoácido de serina a una asparagina, el color cambia a rojo.

Imagen extraída de Sistema Bioluminiscente Luciferina-Luciferasa. Parte

El especto de emisión de espectro para la biolumniscencia de P. pyralis (tipo de luciérnaga) exhibe un pico de 562 nm. La diferencia de color de la emisión debe ser por diferencias en la molécula de la luciferasa.

Seliger and McElroy demostraron que cuando el Ph varia, también la longitud de onda. La ausencia de ZN2+ provoca na emisión de ZN. Con un concrentación de 4*10-4M de Zn presenta una emisión roja.

No obstante, White et Al. Escribieron sobre la emisión quimoluminiscente de una variedad de análogos de luciferina que los llevo a que el rojo surge de la monoanión de la molécula del producto ny la emisión del verde-amarillo del dianión. Presencia de recpetores de protones.

Mientras, McCapra et Al. Y White demostraron que si ellos usaban 5,5,-dimetilluciferina, un compuesto que no puede enolizar la dianion, se observaba una quimioluminiscencia roja.

Información, contrastrada de Marlene DeLucas, Firelfy Luciferase.

SUSTRATOS ESPECÍFICOS

Si la reacción bioluminiscente es iniciada con LH2 y ATP, hay un requerimiento de un catión divalente. Se ha comprobado cinéticamente que es un verdadero sustrato del complejo ATP-Mg. De hecho, un ATP es un inhibidor competitivo con respecto a ATP-Mg. Muchos metales iónicos pueden sustituir al Mg, pero el  Co2+, Mn2+ y el Zn2+ son los más activos. La emisión roja es en presencia de Zn2+.

ESTRUCTURA DE LA LUCIFERASA

La luciferasa es un homodímero donde se alternan los diferentes tipos de estructuras secundarias. Esta hace referencia al plegamiento en el espacio que sufre la secuencia de aminoácidos, o llamado péptido, tras su traducción en los ribosomas citosólicos. Normalmente, esta enzima se suele encontrar en vesículas citoplasmáticas.

Para estudiar la estructura de la luciferasa, según pdb 101 2D1S y gracias a chimera

En azul, está representado las  alfa hélices de la estructura secundaria, mientras que en rosa,  las láminas betas, otro tipo de estructura secundarias.

Se encuentran estabilizados por diferentes enlaces, entre ellos puentes de hidrógeno exactamente por 2912 puentes de hidrógeno, como vemos representado en la siguiente imagen:

Además, en esta imagen, se refleja tres de los residuos presentes, dos átomos de Cl en verde, SLU y las moléculas de agua caracterizadas por ser una esfera roja.

 Los aminoácidos subrayados en amarillo son aquellos que forman la alfa hélice, mientras que los subrayados de verde son los encargados de formar las láminas betas. Aquellos rodados de rojo, no corresponde con la estructura de los residuos. Además, nos indica que está formado por más de 500 aminoácidos con un alfabeto de 20 en que se intercambian gracias a un mismo código genético.

Hemos conseguido además, las distancias de algunas moléculas de agua a los residuos más cercanos.

PRODUCCIÓN DE LA BIOLUMINISCENCIA

La bioluminiscencia es una forma de emisión de luz en el curso de una reacción química.

  • BIOLUMINISCENCIA INTRACELULAR

Células especializadas del propio cuerpo de algunas especies (como dinoflagelados) son las encargadas de generar la bioluminiscencia intracelular. Cuya luz se expresa al exterior a través de la piel, o en el caso de las luciérnagas; se intensifica mediante lentes y materiales reflectantes como los cristales de urato.

Muchas especies de calamar y dinoflagelados “Protoperidinium” presentan este tipo de luminiscencia.

  • BIOLUMINISCENCIA EXTRACELULAR

Este tipo de bioluminiscencia se da a partir de la reacción entre la luciferina y la luciferasa fuera del organismo. En el momento que ambos componentes están sintetizados, se almacenan en diferentes glándulas en la piel o bajo esta.

Tanto la expulsión como la mezcla de ambos reactivos en el exterior producen nubes luminosas.

Este tipo de bioluminiscencia es propia de crustáceos y algunos cefalópodos luminiscentes.

SIMBIOSIS CON BACTERIAS LUMINISCENTES

Es el fenómeno de bioluminiscencia más extendido en el reino animal. Los animales poseen pequeñas vejigas (fotóforos) donde almacenan bacterias luminiscentes.

Diversas estructuras especializadas, tienen la función de neutralizar la intensidad de la luz de las especies que la producen continuamente. Generalmente, los órganos luminosos se encuentran conectados al sistema nervioso, permitiéndole al animal controlar la emisión lumínica.

UTILIDAD DE LA LUMINISCENCIA EN LOS ORGANISMOS

  • CAMUFLAJE: muchos animales de las profundidades marinas, utilizan la bioluminiscencia bacteriana para el camuflaje, en el que se confunde con la luz ambiental. La iluminación es controlada por los fotorreceptores según la luminosidad del fondo marino.
  • ATRACCIÓN DE PRESAS Y PROTECCIÓN CONTRA DEPREDADORES: varios peces de aguas profundas, hacen uso de la bioluminiscencia como señuelo para atraer presas. Este tipo de peces, poseen un apéndice colgante en la cabeza. Por otra parte, los dinoflagelados utilizan la bioluminiscencia para la defensa ante los depredadores.
  • DISTRACCIÓN: al igual que los calamares hacen uso de su tinta, ciertos calamares y pequeños crustáceos utilizan mezclas bioluminiscentes. Una nube de este material es expulsado con el objetivo de distraer o repeler a los depredadores, dándoles la oportunidad e escapar.

BIOLUMINISCENCIA BACTERIANA

            En los seres vivos, la emisión de luz puede ser de dos tipos:

  • FOTOLUMINISCENCIA: (fosforescencia y fluorescencia), debida a la presencia de moléculas fotoexcitables que absorbe luz a una determinada longitud de onda y la emiten a una longitud de onda mayor.
  • QUIMIOLUMINISCENCIA: (bioluminiscencia) en la que la energía química procedente de una reacción química exergónica se transforma en energía luminosa, por lo que no depende de l absorción previa de luz.

IMPLICACIONES BIOMÉDICAS:

Las proteínas bioluminiscentes son muy utilizadas en una gran variedad de campos como: descubrimiento de medicamentos, análisis de la expresión de genes, estudio sobre la dinámica de las proteínas, etc. Las proteínas más utilizadas son las luciferasas que poseen varias características, entre las cuales las más destacadas son: un alto rendimiento cuántico (por cada sustrato que reacciona se produce una elevada cantidad de fotones) y ausencia de toxicidad cuando se expresan en células o en organismos diferenciados.

Una de las investigaciones más destacadas en la que destaca la utilización de la luciferasa es el estudio sobre la reparación de ADN debido a la exposición a la luz UV. En este estudio se utiliza la expresión de los genes encargados de la producción de luz (bioluminiscencia), que proceden de bacterias bioluminiscentes. El origen de este estudio procede de la observación de que la luminiscencia puede estimularse por la radiación UV incluso en cultivos diluidos (bajo condiciones en los que la emisión de luz por esta bacteria está mermada). De este modo, una de las hipótesis propuestas fue que estas bacterias luminiscentes tenían una fuente de luz interna que podría ser utilizada en procesos de reparación del ADN por fotoreactivación.

Otro de los estudios que está relacionado con la reparación del ADN a través de la bioluminiscencia y la luciferasa, utiliza biosensores bioluminiscentes para evaluar el daño producido por la luz UV.

En la creación de numerosos tratamientos que están siendo aún elaborados y puestos a prueba, la carga parasitaria es uno de los parámetros fundamentales para comprobar y evaluar la eficacia de ese tratamiento. Ésta se ha determinado hasta el presente por métodos laboriosos y poco sensibles. Por esta razón, en algunos estudios (como en el de la comprobación de la eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana), se utiliza un método luminométrico para cuantificar la carga parasitaria presente en los tejidos después del tratamiento. La enzima luciferasa de la luciérnaga (Photynus pyralis) se está utilizando en forma creciente como gen reportero en biología celular.

Ejemplo: L. panamensis transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC expresa la luciferasa, lo que permite cuantificar los parásitos en una muestra utilizando un luminómetro.

La curva anterior representa la correlación entre el número de amastigotes de L. panamensis transfectada con el vector pGL2-aNEO- y la actividad de la enzima luciferasa.

LUMINOMETRÍA:

La luminometría trata de una técnica que es utilizada para la determinación de un compuesto químico cuantificando la energía lumínica (emitida normalmente en forma de luz visible o UV) que emite en unas determinadas condiciones.

La reacción entre la luciferina y la luciferasa aparece en la naturaleza (luminosidad en luciérnagas) y en presencia de ATP produce un compuesto que emite luz visible. El ATP es la unidad de energía utilizada por las células y se produce en varios procesos metabólicos que ocurren en los seres vivos (fotosíntesis, respiración en hongos, fermentación de las levaduras, …).

Cuando se quiere comprobar la eliminación o ausencia de microorganismos, restos de tejidos, células humanas, etc. Utilizamos la propiedad que tiene el ATP de liberar energía en forma de luz en presencia de luciferina y luciferasa. La luz resultante puede ser transformada en un impulso eléctrico que puede convertirse en una señal análoga. Para ello utilizamos el Luminómetro, para detectar la cantidad de moléculas de ATP, que resulta en un valor de “unidades relativas de luz”.

La presencia de un valor importante de microorganismos resulta en grandes cantidades de ATP que producirán cantidades elevadas de RLU´s (Unidades relativas de luz). De este modo podemos establecer un rango de contaminación de la superficie:

Esta técnica es utilizada para un monitoreo de condiciones higiénicas en la elaboración o manipulación de alimentos, producción de medicamentos o de una institución hospitalaria.

BIBLIOGRAFÍA:

A. Martín, S. S. (2010). Bioluminiscencia bacteriana. Reduca (Biología). Serie Microbiología, 75-86.

A. Samantha, V. L. (2019). MÁSTER OFICIAL EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y BIOMEDICINA Estudio del efecto de la NEDDilación sobre la expresión de MMP-9 en un modelo de Leucemia Linfática Crónica . INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MARQUÉS DE VALDECILLA -.

Ilyina, A. D., Cerda, F. R., Estrada, B. C., Dukhovich, A. F., Gaona, L. G. J., Garza, G. Y., & Rodríguez, M. J. (1998). Sistema Bioluminiscente Luciferina-Luciferasa de las Luciérnagas. Parte I: Propiedades Bioquímicas y Catalíticas de la Enzima Luciferasa. Journal of the Mexican Chemical Society42(3), 99-108.

Ramírez Joaquín, A. M. (2014). Enzimas, ¿qué son y como funcionan? Revista Digital Universitaria Universidadad Autonoma de Mexìco, 1-13.

Guía didáctica ilustrada de Biología, 2 bachillerato, Biología, José Antonio Pozo Luna

Advances in enzimology and related areas of molecular biology fpunded ny F.F. Nord. Cornell university medical collegue  edited bt Alton Meister

Hernán, H., Osorio, Y., Gore, N., Gómez, A., & Travi, B. (2004). Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime® y Pentostam®) en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana: aplicación de la luminometría. Biomédica24(4), 393-402.

https://www.covidex.com.ar/2019/04/25/luminometria/